Mikrovesikel als interzelluläre Transport- und Kommunikationsvehikel der extrazellulären RNA : Charakterisierung von Mikrovesikeln aus stimulierten Mastzellen

Abstract

Mikrovesikel (MV) sind als Abschnürung von Zellen entstehende extrazelluläre, Granula-ähnliche Membran-umhüllte Partikel, die zytoplasmatische und transmembrane Moleküle der Mutterzelle enthalten können. Sie dienen nicht nur als Biomarker bei kardiovaskulären und Entzündungserkrankungen, sondern tragen durch ihre Interaktionen mit Zielzellen über Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen und nachfolgende Internalisierung zum Transfer von z.B. Oberflächenproteinen und genetischem Material als interzelluläres Kommunikationssystem bei. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass körpereigene extrazelluläre RNA (eRNA) nach Stimulierung von Mastzellen in MV-assoziierter Form zu finden ist und proinflammatorische Eigenschaften besitzt. In dieser Arbeit wurden diese mit eRNA beladenen MV stimulierter Mastzellen charakterisiert. Nach Stimulation von humanen Mastzell-Linien mit verschiedenen Stimulationen bzw. unter bestimmten Stressbedingungen (u.a. Ionomycin und Hypoxie) wurden MV aus den Kultur-überstanden isoliert und mittels Fluoreszenz-aktivierter Durchflusszytometrie und anderer Methoden charakterisiert. Die beobachtete Freisetzung der MV verlief parallel zur Degranulierung der Mastzellen. Die in den Überständen der Mastzellen gefundene eRNA (über-wiegend ribosomale RNA) war nicht in freier Form sondern zum größten Teil in den Calcium-abhängig gebildeten MV zu finden. Mittels lichtmikroskopischer (Immunfluoreszenz) und elektronenmikroskopischer (Immunogold-Markierung) Verfahren wurde die intravesikuläre Lokalisierung der eRNA zusammen mit dem ribosomalen Protein L11 nachgewiesen. Während die in MV eingeschlossene eRNA nicht ohne Weiteres durch RNase1 angreifbar war, führte eine Permeabilisierung der MV mit sehr gering konzentrierter Detergenslösung (0,01% Triton) und RNase1 (ohne die Integrität der MV zu verletzen) zur Hydrolyse der eRNA. Neben der eRNA enthalten die beschriebenen MV die ribonukleo-lytisch kaum aktive RNase5 (Angiogenin), so dass die MV-assoziierte eRNA funktionell intakt bleibt und z.B. von Makrophagen (THP-1 Zellen) energieabhängig aufgenommen wurde. Die experimentellen Daten dieser Arbeit (Elsemüller AK, Tomalla V et al., FASEB J. 2019;33:5457-5467) zeigen, dass Stimuli der Mastzell-Degranulierung auch eine vermehrte Absonderung von eRNA tragenden MV bewirken, die z.B. eine funktionelle Aktivierung von Endothelzellen induzieren. Damit wurde die für ihre proinflammatorischen Eigenschaften bekannte, von Mastzellen freigesetzte, MV-assoziierte eRNA hinsichtlich ihrer Transportform im Entzündungsgeschehen charakterisiert. Microvesicles (MV) are released by budding off from the plasma membrane and represent extracellular vesicles that are similar to granules. They contain various cytoplasmatic and transmembrane proteins of their mother cell. On the one hand, MV can be used as biomarkers of cardiovascular and inflammatory diseases and on the other hand, they are part of the intercellular communication system by transferring surface molecules and genetic material to target cells as well as by promoting ligand-receptor interaction with consecutive internalization. Our group has shown, that after the stimulation of mast cells self-extracellular RNA (eRNA) can be found aossociated with MV and functions as a proinflammatory mediator. The focus of this work was to characterize these eRNA containing MV. After the exposition of human mast cells to various stimuli (e.g. ionoymcin) or hypoxia, MV were isolated from the supernatant. They were then characterized by FACS-analyses and other methods. The release of MV is a process, which happens in parallel with degranulation. The eRNA (predominantly ribosomal RNA) found in the supernatant was mainly enclosed by MV, that were released in a calcium-dependet manner. Electron microscopy (immunogold labelling) and light microscopy (immunofluorescence) showed an intravesicular localization of eRNA and its co-localization with the ribosomal protein L11.Whereas eRNA enclosed by MV was protected from RNase, the addition of a very low concentration of detergent (0.01% triton X-100) helped to hydrolyze the intravesicularly located eRNA without lysing the membrane of the vesicles. Moreover, MV contain an increased amount of angiogenin (RNase 5), which exhibits only little ribonucleolytic function. MV associated eRNA thus remains intact and is taken up by macrophages in an energy-dependent way. The experimental data of this work (recently published: Elsemüller AK, Tomalla V et al., FASEB J. 2019; 33:5457-5467 ) demonstrate, that stimuli which induce the degranulation of mast cells are also able to promote the formation of eRNA carrying MV, that are functionally activating endothelial cells. These results characterize mast cell derived proinflammatory MV associated eRNA as a new transfer system in inflammation.