Etablierung einer Methode zur Untersuchung der Endozytose von Chylomikronen durch Leukozyten

Abstract

Chylomikronen sind Lipoproteine die durch eine geringe Dichte, große Partikeldurchmesser und einen hohen Triglycerid-Anteil charakterisiert sind. Ihre Hauptfunktion ist der Transport von Nahrungslipiden über die Lymph- und Blutbahn zu verschiedenen Geweben. Ob eine Aufnahme von Chylomikronen durch T-Zellen erfolgt und die T-Zellfunktion beeinflusst, wurde bisher wenig untersucht. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die eine Beobachtung der Endozytose von Chylomikronen durch Leukozyten ermöglicht. Die Isolierung der Chylomikronen aus Plasma erfolgte durch mehrere Zentrifugations- und Waschschritte. Durch Elektrophorese sowie durch Western-Blot Analyse mit Apolipoprotein B-48-Antikörpern wurden Chylomikronen in der Endpräparation nachgewiesen. Diese wurden mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) konjugiert. Gebundenes FITC konnte durch Western-Blot-Analyse mit einem anti-FITC-Antikörper nachgewiesen werden. Für die Endozytoseversuche wurden zwei T-Zellrezeptor-positive Zelllinien (MOLT 14 und MOLT 16) und eine Makrophagenzelllinie (Mono-Mac-6) verwendet. Nach Inkubation mit FITC-markierten Chylomikronen wurde bei allen drei Zelllinien eine Fluoreszenz der Zellen durchflusszytometrisch nachgewiesen. Durch konfokale Mikroskopie wurden zytoplasmatische, teilweise granuläre fluoreszierende Strukturen beobachtet. Die Ergebnisse der Arbeit bestätigen die spezifische Aufnahme von Chylomikronen durch Zellen des Immunsystems. Chylomicrones are one main group of lipoproteins characterized by low density, enormous particle diameter and a high portion of triacylglycerid. Chylomicrones are formed in the intestinal mucosa. Their main function is to transport alimentary lipids via the lymph- and bloodstream to various tissues. Whether chylomicrones are absorbed by cells of the immune system and what importance such a process has for the function of the immune system has not yet been tested extensively. For the presented paper a method to monitor the endocytosis of chylomicrones was developed. Multiple zentrifugation- and washing-steps were used to isolate the chylomicrones from human plasma. Conjugation with fluorescein-isothiocyanat (FITC) accomplishes a labelling of chylomicrones with fluorescence. Electrophoreses under natural conditions in an agarose-matrix as well as detection of the specific apolipoprotein B-48 in a western-blot were applied in order to confirm the identity of chylomicrones. FITC attached to apolipoproteins was detected by means of western-blot-analysis with anti-FITC-antibody. In processing the endocytosis-experiments three cell lines were made use of: A macrophage cell line (Mono-Mac-6), a a/ß-T-cell receptor positive (MOLT 16) and a γ/δ-T-cell receptor positive cell line. After incubation with FITC-marked chylomicrones flow cytometry verified fluorescence in all three cell lines. Convocal microscopy even made visible zytoplasmatic, in parts granular fluorescencing structures. Endozytosised chylomicrones though could not be verified by electron microscopy.