1. Ziel und Gegenstand der Untersuchungen
Ziel dieser Arbeit war es, zum einen Peptaibiotika, welche die nichtproteinogene Aminosäure alpha-Aminoisobuttersäure (Aib) enthalten und biologische Aktivität aufweisen, mittels Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) zu sequenzieren.
Die zum Teil bereits als Rohmaterial vorliegenden Peptaibiotika sollten in ihrer Struktur aufgeklärt werden, bekannte Sequenzen bestätigt und neue Analoga bestimmt werden. Weiterhin sollten Schimmelpilze in Submerskultur angezogen werden und die von ihnen gebildeten Peptaibiotika durch chromatographische Verfahren isoliert und anschließend sequenziert werden. Weiterhin sollte eine schnelle und aussagekräftige Screeningmethode zur Bestimmung der Peptaibiotika-Produktion von Schimmelpilzen entwickelt und durchgeführt werden. Hierbei stand die schnelle Bestimmung von Teilsequenzen unter Verwendung von geringen Mengen an Probenmaterial im Vordergrund.In abschließend durchgeführten biologischen Aktivitätstests sollten antibiotische Wirkungen der Isolate geprüft werden.
2. Untersuchungsmethoden
Die Isolation, Detektion und Analyse neuer Peptaibiotika wurde unter Verwendung der Dünnschichtchromatographie (DC), der (semipräparativen) Hochauflösenden Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) sowie der Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS), welche eine Analyse der Aminosäurezusammensetzung sowie der Aminosäure-Chiralität der Peptaibiotika ermöglicht, durchgeführt. Zur Bestimmung der Primärstruktur der Peptaibiotika wurde die Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) bzw. multiple MS (ESI-MSn) im positiven und negativen Ionisierungsmodus eingesetzt, womit charakteristische Massenfragmente erhalten wurden.
3. Ergebnisse der Untersuchung
Unter Anwendung dieser Isolations-, Analysen- und Strukturaufklärungsmethoden konnten neue Sequenzen der Peptaibole Alamethicin F30, Suzukacillin A und Trichobrachin bestimmt sowie bereits bekannte Sequenzen bestätigt werden.
Aus dem mikroheterogenen Peptaibol-Gemisch Alamethicin F30, isoliert aus Trichoderma viride NRRL 3199, wurden die Sequenzen von acht neuen Komponenten und den beiden in der Literatur bekannten Hauptkomponenten, aufgeklärt bzw. abgesichert.
Für Suzukacillin A, isoliert aus Trichoderma viride, strain 63 C-I, konnten mittels HPLC-ESI-MS mehr als 90% der 20er Peptide neu aufgeklärt und differenziert werden und die 15 Sequenzen dem HPLC Elutionsprofil zugeordnet werden.
Zur Analyse der Trichobrachine (TB) wurde der Schimmelpilz Trichoderma parceramosum CBS 936.69 in Submers-Kultur angezogen, die gebildeten Peptaibiotika aufgereinigt und die TB-Gruppen I-III mittels semipräparativer DC isoliert. Für TB I wurden Sequenzen von 10 acetylierten Peptiden mit je 19 Aminosäuren ohne Aminoalkohol bestimmt. In der TB-Gruppe II bestanden die Peptide aus 18 Aminosäuren ohne Aminoalkohol bzw. aus 19 Aminosäuren und dem C-terminalen Aminoalkohol L-Pheol. In TB III wurden Sequenzen von insgesamt 34 11er-Peptiden mit C-terminalen Aminoalkohol bestimmt.
Die zur Untersuchung der Peptaibiotika-Produktion verschiedener Schimmelpilze entwickelte schnelle und aussagekräftige Screeningmethode wurde im Begriff Peptaibiomics zusammengefasst. Dies umfasst sowohl die Aufreinigung des von einer vollbewachsenen Nähragarplatte gewonnenen Mycelextraktes mittels Festphasenextraktion, als auch die Verwendung von HPLC-UV und HPLC-ESI-MS. Hiermit konnten Peptaibiotika aus Pilzen der Gattung Trichoderma und Hypocrea erfasst und Teilsequenzen ermittelt werden, mit denen anhand eines Vergleiches mit bereits bekannten Strukturen in einer Peptaibol-Database Aussagen über bekannte oder neue Peptaibiotika-Produzenten getroffen werden konnten.
Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit Tests auf mikrobiologische Aktivitäten der sequenzierten Peptaibiotika gegen Bacillus subtilis unter Verwendung von Mikrotiterplatten etabliert. Diese Untersuchungen der biologischen Aktivitäten wiesen den Einfluss von Struktur und Konzentration der Peptaibiotika auf die antibiotische Wirkung nach.
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