Aktivierung der Proteostase durch Quercetin als molekularer Mechanismus der Prävention Glukose-induzierter Schädigungen : Untersuchungen an der mev-1 Mutante des Nematoden Caenorhabditis elegans

Abstract

Die chronische Hyperglykämie ist ein grundlegendes Charakteristikum des Diabetes mellitus. Sie gilt als Hauptursache für die Entstehung diabetischer Komplikationen und wird mit dem frühzeitigen Tod von Individuen assoziiert. Proteine vermitteln den Hauptteil zellulärer Funktionen und sind gleichzeitig die Makromoleküle mit der höchsten Sensitivität gegenüber zellulären Stresskonditionen aller Art. Die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase, der Proteostase, ist folglich unabdingbar für die Funktionalität der Zelle. Umgekehrt begünstigen Schädigungen von Elementen des Proteostase-Netzwerks die Pathogenese und Progression verschiedener Erkrankungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Stamm TK22 des Nematoden C. elegans als Modellorganismus herangezogen, um Glukose-induzierte Schädigungen sowie deren Prävention durch das Polyphenol Quercetin auf molekularer Ebene zu untersuchen.Die durch Glukose-induzierte Verkürzung der Überlebenszeit von TK22 konnte durch die zusätzliche Gabe von mikromolaren Quercetin-Konzentrationen verhindert werden. Um Proteostase-relevante Gene zu identifizieren, deren Funktionalität Voraussetzung für die präventive Wirkung des Quercetins ist, wurde die Expression entsprechender Gene mittels RNA-Interferenz (RNAi) vermindert. Dabei stellte sich heraus, dass die fehlende Aktivität von zentralen Genen der Unfolded Protein Response im Mitochondrium (UPRmt), wie hsp 60 und atfs-1, die Überlebenszeit von TK22 verkürzte und die Verlängerung der Überlebenszeit unter Glukoseexposition durch Quercetin verhinderte. Glukose führte zwar zu einer Stressantwort, wie anhand der Steigerung der Expression des Mitochondrien-spezifischen Chaperons hsp-60 gezeigt wurde. Diese reichte jedoch nicht aus um die Glukosetoxizität zu verhindern. Die RNAi des zentralen Transkriptionsfaktors XBP-1 der Unfolded Protein Response im ER (UPRER) führte ebenfalls zur Ineffektivität des Quercetins. Interessanterweise bewirkte die zusätzliche RNAi des für die Aktivierung von XBP-1 notwendigen Gens ire-1 keine zusätzliche Verkürzung der Überlebenszeit von mit xbp-1 RNAi behandelten Nematoden, sondern eine Verlängerung. Als ursächlich hierfür wurde die Aktivität der Proteinkinase PEK 1 identifiziert, die offenbar innerhalb eines zum IRE-1/XBP-1 parallelen Signalwegs dessen Ausfälle überkompensiert.Des Weiteren wurde die Bedeutung der beiden zentralen Abbauwege für geschädigte Proteine, der Autophagie und des proteasomalen Abbaus, im Hinblick auf die Glukosetoxizität verhindernden Effekte des Quercetins untersucht. Während die Effektivität des Quercetins durch eine Hemmung des Proteasoms mittels pbs-4 RNAi vollständig unterdrückt wurde, konnte die Glukosetoxizität durch Hemmung der Makroautophagie sowie der Chaperon-vermittelten Autophagie mittels RNAi von lgg-2 bzw. lmp-2 vollständig verhindert werden. Die Hemmung der Autophagie führte dabei zu einer Steigerung der proteasomalen Aktivität, die sich als essentiell für die Verhinderung der Glukosetoxizität erwies und auch als der durch Quercetin aktivierte Mechanismus identifiziert wurde. Auch die Kompensationsmechanismen unter ire-1 und xbp-1 Doppel-RNAi waren abhängig von einer erhöhten Proteasomaktivität und wurden durch die zusätzliche pek-1 RNAi verhindert. Zusammenfassend ist festzustellen, dass Quercetin eine Glukosetoxizität in C. elegans TK22 in Abhängigkeit verschiedener Faktoren der UPR vollständig verhindert. Sowohl Quercetin, als auch die Hemmung zentraler Elemente der UPR und der Autophagie resultierten in einer Aktivierung des Proteasoms, das dementsprechend als entscheidendes zu aktivierendes Element im Hinblick auf die Prävention durch Glukose verursachter Schädigungen identifiziert werden konnte. Chronic hyperglycemia is a hallmark of diabetes mellitus. It is a principal contributor to the development of diabetic complications and is associated with premature death of organisms. Proteins mediate the bulk of cellular functions and are simultaneously the macromolecules with the highest sensitivity to all forms of cellular stress conditions. Consequently, the maintenance of protein homeostasis, proteostasis, is indispensable to cellular functionality. Conversely, impairment of proteostasis members promotes the pathogenesis and progression of various diseases. In the present work the TK22 strain of the nematode Caenorhabditis elegans was used as a model organism to study glucose-induced damages and their prevention by the polyphenol quercetin at the molecular level.The glucose-induced survival time reduction of TK22 was prevented by the additional administration of micromolar quercetin concentrations. In order to identify relevant genes of the proteostasis network, which are required for the preventive effect of quercetin, the expression of respective genes was decreased by RNA-interference (RNAi). By doing so the missing activity of central genes of the mitochondrial unfolded protein response (UPRmt), i. e. hsp-60 and atfs-1, was shown to shorten the survival time of TK22 and to prevent the survival prolonging effect of quercetin under glucose exposure. Although the application of glucose activated a stress response in terms of an increased expression of the mitochondrion-specific chaperone hsp-60, this activation was insufficient to prevent glucose toxicity.RNAi for XBP-1, the central transcription factor of the unfolded protein response in the ER (UPRER), also resulted in ineffectiveness of quercetin. Interestingly, the additional RNAi of ire-1, a gene that is required for XBP-1-activation, did not result in an additional survival time reduction of xbp-1 RNAi treated nematodes, but prolonged the survival time. The causative factor for this was identified to be the activity of the protein kinase PEK-1, which apparently overcompensates the failure of IRE-1/XBP-1 signaling in a parallel pathway.The significance of central degradation pathways for damaged proteins, i.e. autophagy and the proteasomal degradation, was also examined with respect to the glucose toxicity-preventing effects of quercetin. Whereas the effectiveness of quercetin was completely suppressed owing to inhibition of the proteasome by pbs-4 RNAi, glucose toxicity was completely prevented due to inhibition of macroautophagy and chaperone-mediated autophagy by lgg-2 RNAi and lmp-2 RNAi, respectively. Inhibition of autophagy resulted in an increased proteasomal activity, which was proven to be crucial for the prevention of glucose toxicity and also identified as the mechanism that was activated by quercetin.Also the compensatory mechanisms in the presence of ire-1 and xbp-1 double-RNAi were dependent on an increased proteasomal activity and were prevented by additional pek-1 RNAi.In conclusion, quercetin completely prevents glucose toxicity in C. elegans TK22 depending on multiple members of the UPR. Since both, quercetin and the inhibition of central elements of UPR and autophagy, respectively, resulted in an activation of the proteasome, the latter was identified as the crucial element, which has to be activated regarding the prevention of glucose-induced damages.