Interaktion der Na+,K+-ATPase mit Palytoxin und herzaktiven Steroiden an drei verschiedenen Isoformen der alpha-Untereinheit sowie die Identifikation von Aminosäuren aus dem Ionophor der Na+,K+-ATPase, die kritisch für den Ionentransport und die Enzymfunktion sind
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Zusammenfassung
Herzglykoside binden spezifisch und reversibel an die a-Untereinheit der Natriumpumpe (Lingrel and Kuntzweiler 1994) und hemmen sie. An drei verschiedenen a-Untereinheiten wurde die Interaktion mit verschiedenen Herzglykosiden und deren Aglykonen untersucht. Am sensitivsten gegenüber Ptx ist die Kombination aus a1b1 (9,5 ± 0,12 nM). Für a2b1 (41,96 ± 0,11 nM) und a3b1 (23,51 ± 0,12 nM ) liegt die Konzentration für den halbmaximalen Kaliumefflux etwa viermal bzw. zweimal so hoch verglichen mit a1b1. Ouabain in µM-Konzentration drängt den Kaliumefflux bei allen drei Isoformen deutlich zurück (90,5%, 95,0% und 96,3% für a1, a2 und a3). Sowohl Oubagenin als auch Digitoxigenin zeigen eine ausgeprägte isoformspezifische Affinität, nicht jedoch das Bufalin. Die Unterschiede zwischen Herzglykosiden mit einem 5er- oder 6er- Lactonring sind nur geringfügig und können z.T. auch durch unterschiedlich gute Wasserlöslichkeiten hervorgerufen sein. Diese Arbeit unterstützt die These, dass die Zuckereinheit der Herzglykoside eine wesentliche Rolle für ihre Hemmung gegenüber Palytoxin spielt. Ouabagenin hebt sich von allen anderen untersuchten Inhibitoren ab, da es bei allen drei Isoformen eine geringe Hemmwirkung zeigt, sehr ausgeprägt vor allem bei a2. Die Untereinheit a2 ist auch diejenige Isoform, die gegenüber den anderen Glykosiden, die in dieser Arbeit verwendet wurden, ein anderes Verhalten zeigt. Einen gewissen Einfluss mag das geringere Expressionsniveau dieser Mutante haben. Die Na+, K+-ATPase (EC 3.6.3.9) gehört zur Familie der P-Typ-ATPasen. Es handelt sich um ein zelluläres Enzym, welches den Ionentransport durch die Zellmembranen bewerkstelligt. In der vorliegenden Arbeit wurden gezielt Aminosäuren der Na+, K+-ATPase homolog bzw. nicht-homolog ausgetauscht, um ihre Rolle bei der Koordination von Natrium- bzw. Kaliumionen zu untersuchen. Der Glutamatrest an Position 779 wurde durch den Austausch gegen Aspartat formell um eine Methylgruppe verkürzt und das hochkonservierte Asparagin 776 wurde in ein Isoleucin mutiert. Da die zum Asp804 korrespondierende Position in der Calcium-ATPase einen Asparaginrest trägt, wurde hier der Austausch Asparat gegen Asparagin vorgenommen. Das hochkonservierte Aspartat 807 wurde sowohl hinsichtlich der Ladung durch Einbau eines Glutamatrestes respektive Alaninrestes verändert. Das mutierte Protein wurde dann heterolog in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Bei Hefen, die die Natriumpumpe mit der Mutation Glu779Asp exprimieren, ist der EC50-Wert etwa neunmal niedriger (0,81 ± 0,08 nM) im Vergleich zum Wildtyp (7,34 ± 1,67 nM). Für die weiteren Mutanten beträgt er 0,43 ± 0,10 nM (Asn776Ile), 3,62 ± 2,82 nM (Asp807Ala) bei 0,28 ± 0,05 nM (Asp807Gln). Die Dissoziationskonstante K0,5 für Ouabain an Membranen des Wildtyp-Enzyms beträgt 44,51 ± 9,69 nM bei einer maximalen Ouabainbindung (Bmax) von 1,09 ± 0,12 pmol/mg Protein. Für die Glu779Asp und Asn776Ile konnten unter den gegebenen Bedingungen weder die Dissoziationskonstante noch die maximale Bindung bestimmt werden. Asp804Asn bindet Ouabain mit geringerer Affinität (K0,5-Wert 104,1 ± 52,18 nM) als der Wildtyp. Membranen mit der Asp807Ala -Mutante haben eine hohe Ouabainaffinität (K0,5-Wert von 10,70 ± 20,03 nM). Die maximale Ouabainbindung jedoch ist sehr gering (0,41 ± 0,21 pmol/mg Protein). Die Asp807Gln -Mutante hat eine sehr viel geringere Affinität als der Wildtyp oder die Mutante Asp807Ala, der K0,5-Wert liegt bei 297,6 ± 18,54 nM Ouabain. Beim Wildtyp wurde ein K0,5- Wert für Kalium von 1,25 ± 0,11 mM bei einer maximalen [3H]Ouabainbindung von 1,50 ± 0,21 pmol/mg Protein berechnet . An den Membranen mit der Glu779Asp-Mutanten konnte keine Veränderung in der Menge des gebildeten [E2*P Ouabain]-Komplexes gemessen werden bei einer ohnehin sehr niedrigen [3H]Ouabainbindung von 0,09 ± 0,08 pmol/mg Protein (vgl. Abb. 45 a). Der K0,5-Wert für K+-Ionen an Membranen mit der Mutanten Asn776Ile ist 0,34 ± 0,04 mM, konnte für die Asp804Asn-Mutante jedoch nicht bestimmt werden. Die spezifische ATPase-Aktivität betrug beim Wildtyp 5,86 ± 0,73 mU/mg Protein. Für die Mutanten Glu779Asp (0,78 ± 2,05 mU/mg Protein), Asn776Ile (1,50 ± 0,30 mU/mg Protein), Asp804Asn (3,01 ± 0,58 mU/mg Protein) sowie Asp807Ala (2,55 ± 0,53 mU/mg Protein) lag der Wert deutlich niedriger. SDS-extrahierte Mikrosomen mit der Mutation Asp807Glu zeigten praktisch keine Aktivität (0,00 ± 0,30 mU/mg Protein). Die Messergebnisse für Glu779Asp deuten darauf hin, dass Glutamat 779 eine wichtige Rolle spielt in der Verbindung der extrazellulären Ionenbindung und der anschließenden intrazellulären Dephosphorylierung des Enzyms. Die Daten aus den Untersuchungen der Mutanten Asn776Ile weisen darauf hin, dass die Selektivität des durch Palytoxin induzierten Ionenkanals erniedrigt worden ist. Im Umkehrschluss bedeutet dies für das Asparagin an Position 776, dass es beteiligt ist an der Ionenerkennung bzw. Ionenkoordination. Zusammenfassend ist für das Aspartat804 zu beobachten, dass durch den Wegfall der negativen Ladung die Affinität für Kalium sinkt und die für Natrium steigt. Aspartat 804 spielt offensichtlich eine wichtige Rolle in der Kaliumkoordination. Dieselbe Aussage scheint auch für die Position 807 zuzutreffen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die These, dass der durch Palytoxin induzierte Kanal das Ionophor der Natriumpumpe ist, welches in permanent-offener Form arretiert wird.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008