Abwasserbasierte Epidemiologie und Surveillance am Beispiel des Nachweises von SARS-CoV-2 aus Krankenhausabwasser: Etablierung der absoluten Quantifizierung mittels digital-PCR

Abstract

Die hier vorliegende Forschungsarbeit hat erste Erkenntnisse zum Aufbau eines abwasserbasierten Surveillance Systems am Universitätsklinikum Gießen geliefert. Zur Generierung erster Daten wurden während der COVID-19-Pandemie 33 Stichproben aus dem Abwasser des Universitätsklinikums gewonnen und ausgewertet. Hierfür wurde ein Protokoll zur Verarbeitung von Abwasser und von RNA-Extraktion etabliert. In allen Proben konnte im Pandemieverlauf in cDNA überführte total-RNA gemessen werden. Weiterhin wurde ein molekularer Nachweis für SARS-CoV-2 erfolgreich eingeführt. Dieser ist die Basis für einen generellen Virusnachweis von SARS-CoV-2 und ist in der Lage auch Virusvarianten zu detektieren. Durch die Verwendung einer digital-PCR wurde die absolute Quantifizierung von SARS-CoV-2 erreicht. Die Wahl des Targets, mit Sequenzen des Spike-Glyko-Oberflächenproteins, war für diesen speziellen Versuchsaufbau sinnvoll. Zukünftig kann auf mittlerweile konventionell erhältliche Kits zum Nachweis zurückgegriffen werden. Auch sollten noch weitere Sequenzen ausgewertet werden, um umfangreichere Datensätze zu generieren. In dem angestrebten generellen und Varianten-unabhängigen Nachweis von SARS-CoV-2 konnten über den beobachteten Pandemieverlauf absolut quantifizierte Daten erhoben wer-den. Die gemessenen Konzentrationen divergierten zum Teil stark, obwohl sich die meisten Proben um den Median von 150 Viruskopien/Liter Abwasser verorten ließen. Möglicherweise lässt sich dies mit der stichpunktartigen Entnahmestrategie in einem niedrig bis mittleren Durchfluss-Abwassersystem erklären. Im spezifischen Nachweis der Omikron-Variante konnte diese Studie Ergebnisse liefern, die mit den Sequenzierungsdaten in Deutschland über das mögliche Vorliegen der Omikron-Variante übereinstimmten. Auch hier wurde eine große Spannweite zwischen den Konzentrationen festgestellt. Generell lieferte die absolute Quantifizierung im Varianten-Nachweis geringere Viruskonzentrationen als im Varianten-unabhängigen Nachweis. Dies kann ein Zeichen dafür sein, dass die Konzentrationen spezifisch für die Variante, als Teilmenge des gesamten Virusnachweises, getestet wurden. Hier war ebenso eine absolute Quantifizierung möglich. Es konnten keine Verlaufsdaten erhoben werden, da dafür zu wenig Proben im Zeitraum des Auftritts der Variante gewonnen wurden. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass potenzielle Krankheitserreger im Abwasser des Universitätsklinikums am Standort Gießen nachweisbar und quantifizierbar sind. Aus der Diskussion ergeben sich folgende Ansätze für weiterführende Versuche: Zu-nächst sollte die Abwasserprobengewinnung angepasst werden. Es sollten die Beprobungsfrequenz und das Probenvolumen erhöht werden. Es sollte eine 24-Stunden-Sammelprobe, mit Abnahmeintervallen von 5 - 15 Minuten, mit den Ergebnissen einer einfachen Stichprobe verglichen werden. Auch sind die oben erwähnten Prozesskontrollmechanismen zu überprüfen und zu etablieren. Die dann gewonnenen Ergebnisse sollten in ein Surveillance System integriert werden, das nicht nur eine digital-PCR verwendet, sondern auch Sequenzierungsdaten erhebt. Damit können abschließend nicht nur Pathogene nachgewiesen werden, für die explizite Primer oder Primer/Sonden-Paare vorliegen, wie in dieser Arbeit, sondern noch viele weitere Pathogene. So könnten auch solche nachgewiesen werden, die initial am Patienten übersehen worden sind. Der Grundstein für ein Abwasser basiertes Surveillance System an der Universitätsklinik Gießen ist damit gelegt.