Gentechnische Herstellung und Charakterisierung der Hämolysine von Brachyspira hyodysenteriae
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Zusammenfassung
Brachyspira (B.) hyodysenteriae ist der Erreger der Schweinedysenterie (SD). Diese Erkrankung ist weltweit verbreitet und spielt auch in Deutschland eine zunehmend größer werdende Rolle. Als bedeutungsvolle Mediatoren in der Pathogenese der Dysenterie stehen, neben anderen Faktoren, die Hämolysine des Erregers (vor allem HlyA und TlyA-C) zur Diskussion. Beispielsweise waren TlyA-Deletionsmutanten avirulent und Hämolysinextrakte von B. hyodysenteriae nach Injektion in Darmloops stark schleimhautschädigend. Die Kenntnisse zu den einzelnen Hämolysinen sind jedoch lückenhaft und durch methodische Mängel belastet. Nach Klonierung der Gene hlyA und tlyA-C in E. coli wurden bisher lediglich die Transformanten, jedoch nicht die isolierten Proteine auf hämolysierende Fähigkeiten geprüft. Dabei wurden die für die Proteine kodierenden Gensequenzen nie alleine, sondern immer in Kombination mit flankierenden Gensequenzen kloniert. Studien an exakt vom entsprechenden Gen kodierten Proteinen liegen nicht vor.Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurden die Hämolysingene von B. hyodysenteriae in E. coli kloniert und die exprimierbaren Proteine nach Reinigung sowohl auf ihre Antigenität und Reaktivität mit Seren infizierter Tiere, als auch auf ihre hämolysierenden und zytotoxischen Eigenschaften gegenüber verschiedenen Säugetiererythrozyten, bzw. -zellkulturen hin untersucht. Insgesamt ließen sich acht Hämolysingene in E. coli-Zellen klonieren. Nur fünf dieser acht Transformanten (ADtlyA, ADtlyB, ADtlyC, ADhlyA und AD962) exprimierten jedoch die entsprechenden Proteine, von denen die rekombinanten Proteine rTlyA-His, rTlyB-His, rTlyC-His und rHlyA-His mittels Affinitätschromatographie über ein angehängtes Histidintag gereinigt werden konnten.Die rekombinanten Hämolysine waren zwar antigen für Kaninchen, es zeigte jedoch nur eins der experimentell infizierten Schweine eine Serokonversion gegen TlyA. In Anbetracht der Tatsache, dass die anderen experimentell infizierten Schweine keine Serokonversion zu TlyA zeigten, wäre die Untersuchung einer größeren Stichprobe notwendig um eine verlässliche Aussage über die immunmodulatorischen Effekte von TlyA treffen zu können. Bei den anderen untersuchten Hämolysinen (TlyB-C und HlyA) konnte keine Serokonversion nachgewiesen werden. Beim Wachstum auf festen Nährböden mit Blut von Rind, Schaf und Pferd bildeten die Transformanten keine Hämolyse aus. Auch führte keiner der Transformanten zu einem positiven CAMP-Phänomen. Extrakte aus den klonierten Bakterien sowie die gereinigten Hämolysine verursachten keine Hämolyse von gewaschenen Schaferythrozyten. Auch konnte keine zytotoxische Wirkung auf Säugetierzellen durch die gereinigten rekombinanten Hämolysine nachgewiesen werden. Auch weitere, entsprechend den Vorgaben aus der Literatur generierte HlyA-Transformanten (die Transformante ADfabUm, welche auch die benachbarten Gensequenzen fabG und fabF enthielt sowie die Klone ADfabG und ADfabF, welche nur die benachbarten Sequenzen fabG und fabF enthielten und ein Klon (ADhlyA ), welcher nur das hlyA-Gen ohne das Fusionsprotein ( Histidintag ) enthielt) zeigten kein, wie von Hsu et al. (2001) beschrieben, hämolysierendes Wachstum auf Blut-Agarplatten. Nach den vorliegenden Untersuchungsergebnissen kann somit die Frage, ob es sich bei den genannten Proteinen tatsächlich um Hämolysine handelt, nicht eindeutig beantwortet werden. Zweifel an der Funktion der bei Brachyspiren vorkommenden Proteine HlyA und TlyA-C als Hämolysine scheinen nicht ganz unberechtigt zu sein. Dennoch sind diese Proteine gute Antigene, wobei es aufgrund der fehlenden Serokonversion in Seren infizierter Tiere fraglich ist, ob hieraus eine immunrelevante Bedeutung resultiert.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler