Die pflanzlichen Herzglykoside Ouabain und Digoxin regulieren nach neueren Erkenntnissen in Säugetieren als Steroidhormone derNebenniere den Salz- und Wasserhaushalt. Da Steroidhormone gebunden an spezifische Bindungsproteine im Blut transportiert werden,sollte ein neu nachgewiesenes Bindungsprotein für Herzglykoside aus Rinderblut gereinigt und weiter charakterisiert werden. Nach dem Nachweis des Herzglykosidbindungsproteins CGBG durch Affinitätsmarkierung mit dem proteinreaktiven DigoxigeninderivatN-hydroxysuccimidyl-Digoxigenin-3-o-methyl-aminocaproat (HDMA) gelang es spezifische Antikörper zu gewinnen. Damit konnte dasBindungsglobulin CGBG aus der Globulinfraktion des Rinderserums 900 000-fach gereinigt werden. Hierzu waren eine Vorreinigung desProteins am Kationenaustauuscher CM-Sephadex, eine Affinitätschromatographie an einer spezifischen Antiköpersäule und eineNachreinigung an der Anionenaustauschersäule Phenomenex Biosep DEAE erforderlich. Die Proteinausbeute der in 3 Tagendurchzuführenden Proteinreinigung betrug 0,0001%.
Das Herzglykosidbindungsprotein ist ein Glykoprotein von Mr 90 kDa in der SDS-PAGE. Der N-Terminus ist durch Pyroglutamat blockiert.Nach Deblockierung mit Pyroglutamase kann durch Edman Abbau die Sequenz ALPNVETSV bestimmt werden. Für sie und eine weiteremit Lys-C erhaltene Sequenz KDLESHYLFERH, sowie eine durch CNBr-Spaltung erhaltene Sequenz GKLFNIVNKXQQAL fanden sich inden SwissProt- und TrEMBL-Datenbanken keine Sequenzhomologien. Das Protein ist somit bisher unbekannt. Der Kohlenhydratanteil desCGBG enthält u.a. Neuraminsäuren, wie durch Interaktion mit verschiedenen Lektinen bestimmt werden konnte. Die N-glycosidisch amProtein gebundenen Kohlenhydrate tragen 10-15% zur Molmasse bei. Unterschiedliche Glykosylierungsmuster erklären die Heterogenitätdes IEP des nativen Proteins zwischen pH 4,4 und 5,6; denn nach Deglykosylierung ist der IEP 5.6. Mittels Molekularsiebchromatographieergab sich für das native CGBG eine Molmasse von 820 kDa und unter denaturierende Bedingungen von 180 kDa. Es wird darausgeschlossen, daß das Herzglykosidbindungsprotein ein Pentadimer von 180 kDa ist, in dem die Monomere von 90 kDa durchDisulfidbrücken verknüpft sind.
Mittels Affinitätsmarkierung mit HDMA und mittels Tryptophanfluoreszenzlöschung wurden die spezifische Interaktion des gereinigtenProteins mit Herzglykosiden nachgewiesen. Es gelang 2 Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität von Kd1 = 2,4 nM und von Kd2 = 500 nMnachzuweisen. Das Protein interagiert nicht mit anderen Steroidhormonen.
Gegen das isolierte 90 kDa-Herzglykosidbindungsprotein konnten in Kaninchen spezifische polyklonale Antikörper erzeugt werden. Sieerkannten nur die 90 kDa Proteinbande in einer teilweise gereinigten Proteinfraktion.
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