Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den 'Salmonella plasmid virulence'-Faktor D (SpvD) auf seine Eignung zum Testantigen für die serologische Diagnostik zu untersuchen. Im einzelnen sollte ermittelt werden, mit welcher Häufigkeit das spvD-Gen bei den gegenwärtig in Deutschland bei Tieren verbreiteten Salmonellen vorkommt, wie stark das SpvD in seiner Primärstruktur innerhalb des Genus Salmonella variiert und ob es im Zuge von Salmonelleninfektionen zur Immunreaktion gegen das SpvD-Protein kommt.
Salmonella-enterica-Feldisolate (n = 874), die in den Jahren 1990 - 1999 von Tieren in Deutschland isoliert worden waren und die 18 verschiedenen O-Gruppen angehörten, wurden mittels DNS-DNS-Hybridisierung im Dot-Blot- und Southern-Blot-Verfahren auf das spvD-Gen untersucht. Das spvD-Gen war ausschließlich bei Vertretern von Salmonella enterica Subspezies enterica nachweisbar, wobei 75 % der untersuchten S. Gallinarum/Pullorum-Stämme, 93,5 % der S. Typhimurium-Isolate, jeweils alle S. Enteritidis- und S. Dublin-Isolate sowie beide getesteten Salmonella-Rauhform-Isolate positiv reagierten. Infolge der tierartlich verschiedenen Serovarspektren waren Salmonellen-Isolate von Säugern häufiger Träger des Gens als Isolate von Vögeln oder Reptilien (Rinder 93,9 %, Pferde 92,9 %, Hund/Katze 58,9 %, andere Säu-ger 66,7 %, Vögel 33,3 %, Reptilien 4,6 %).
Um die Strukturvariabilität des SpvD-Proteins zu bestimmen, wurden die spvD-Gene von 17 Salmonella-Feldstämmen sequenziert und in die Aminosäuresequenzen übersetzt. Unter Einbeziehung bereits bekannter spvD-Sequenzen konnten insgesamt neun spvD-Allele differenziert werden, aus denen sich acht SpvD-Varianten mit unterschiedlicher Aminosäuresequenz ableiten ließen. Mit Ausnahme des spvD-Gens von S. Gallinarum Stamm Ti 184/64 waren die Unterschiede insgesamt gering und serovarabhängig. Beim paarweisen Vergleich betrug die Homologie der Nukleotidsequenzen mindestens 98,8 % (ClustalW-Methode) und die Homologie der Aminosäuresequenzen mindestens 97,7 % (Jotun-Hein-Methode). Dabei waren alle Stämme der Serovare Typhimurium und Dublin in der SpvD-Primärstruktur identisch. Im spvD-Gen von S. Gallinarum Stamm Ti 184/64 war das Codon 73 infolge einer Punktmutation zum Stopcodon mutiert, weshalb dieser Stamm nur für ein N-terminales SpvD-Rudiment kodierte.
Zur Untersuchung der immunogenen Bedeutung von SpvD wurden drei Gruppen von BALB/c-Mäusen zu je neun Tieren oral mit Keimen der Serovare Typhimurium, Enteritidis und Dublin infiziert. Innerhalb der dreiwöchigen Beobachtungsdauer war eine systemische humorale Immunreaktion gegen SpvD und LPS bei zwei (22,2 %) der mit S. Dublin-Keimen infizierten Mäuse nachweisbar. Diese beiden Mäuse sowie sechs weitere Mäuse (29,6 %) aus allen drei Gruppen reagierten auch gegen das jeweilige autologe Bakterienzelllysat serologisch positiv. Die ermittelten Immunglobulin-Titer korrelierten signifikant positiv miteinander und mit der Inokulationsdosis, der Dauer der Erkrankung sowie dem Leber- und Milzgewicht zum Zeitpunkt der Euthanasie (p &
#8804; 0,039).
Serumproben von 56 Salmonella-infizierten Pferden und 71 kulturell-bakteriologisch Salmonella-negativen Pferden wurden mittels ELISA auf Salmonella-spezifische Antikörper untersucht. Hierbei dienten hochreines rekombinantes SpvD (rSpvD-His) sowie chromatografisch aufgereinigtes LPS von S. Typhimurium (LPSTm) als Testantigene. Die ELISA-Qualität (Summenmaximum aus Sensitivität und Spezifität) wurde anhand von 'receiver operating characteristic'-Kurven auf Grundlage der kulturell-bakteriologischen Befunde bestimmt. Antikörper gegen rSpvD-His und LPSTm konnten in beiden Pferdegruppen nachgewiesen werden. Dabei korrelierten die beiden Tests in ihren Werten signifikant miteinander (p < 0,001). Bei den älteren Pferden (> 6 Monate) besaßen die Salmonellenausscheider unabhängig vom Test-antigen im Mittel signifikant höhere Titer als die Salmonella-negativen Pferde (p < 0,001). In dieser Altersgruppe war der rSpvD-His-ELISA zu 75,9 % spezifisch und zu 70,6 % sensitiv, während der LPSTm-ELISA eine Spezifität von 85,2 % und eine Sensitivität von 70,6 % erzielte. Bei jüngeren Pferden waren die Titer durchwegs niedrig und ein Unterschied zwischen Salmonella-Positiven und Salmonella-Negativen nicht nachweisbar (p > 0,05).
Nach diesen Ergebnissen ist der Virulenzfaktor SpvD ein strukturell hochgradig konserviertes Antigen, das bei den derzeit bei Haustieren zirkulierenden Salmonella-Stämmen mit sehr hoher Prävalenz vorkommt. Aufgrund des besonders hohen Anteils spvD-positiver Salmonellen bei Pferden und Rindern erscheint rekombinantes SpvD als Testantigen bei diesen Tierarten besonders gut geeignet. Als diagnostischer Marker zur Identifizierung von Salmonella-verdächtigen Bakterienisolaten ist das spvD-Gen aber im Vergleich zu anderen genetischen Markern nicht sensitiv genug.
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