Das inflammatorische Tumormikromilieu in der Pathogenese des Lungenkarzinoms: Rolle bakterieller Pathogenitätsfaktoren und aktivierter Leukozyten

Abstract

Mittlerweile gilt die Inflammation als ein entscheidender Faktor in der Pathogenese zahlreicher solider Tumoren. Pulmonale bakterielle Infektionen stellen eine häufige Komplikation im Krankheitsverlauf des nicht kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) dar. Die isolierten bakteriellen Pathogenitätsfaktoren Lipopolysaccharide (LPS) gramnegativer Keime und deren gram¬positive Äquivalente Lipoteichonsäuren (LTA) lösen hierbei pulmonale Inflammationsreaktionen aus. So könnte ein verändertes Tumormikromilieu (TME) entstehen, das u. a. durch die Präsenz proinflammatorischer Mediatoren und die Infiltration neutrophiler Granulozyten (PMN) gekennzeichnet ist. Vor diesem Hintergrund sollte die Frage beantwortet werden, ob LPS und LTA die Tumorprogression im NSCLC direkt oder über die Aktivierung von PMN beeinflussen können. Die hier vorgelegten Untersuchungen zeigen, dass die bakteriellen Pathogenitätsfaktoren LPS und LTA direkt mit NSCLC-Zellen interagieren und die Tumorproliferation in vitro an unterschiedlichen NSCLC-Zelllinien induzieren (Anlagen 1, 2). Diese Effekte konnten an ex vivo kultiviertem humanen Lungengewebe und in einem Mausmodell reproduziert werden (Anlage 1). Neben diesen unmittelbaren Effekten auf die Tumorzellproliferation induzieren diese Pathogenitätsfaktoren auch eine Strahlenresistenz an NSCLC-Zelllinien (Anlage 3). Eine Interaktion von bakteriellen Pathogenitätsfaktoren mit Tumorzellen scheint im NSCLC tatsächlich stattzufinden, da Nejman et al. kürzlich LPS und LTA im Tumorgewebe des NSCLC nachweisen konnten (71). In den hier vorgelegten Untersuchungen induzierten LPS und LTA eine quantitativ gleichermaßen ausgeprägte Proliferationsreaktion in NSCLC-Zellen in vitro, die in aktuellen Publikationen reproduziert werden konnte (79, 80). Die pro-proliferativen Effekte von LPS wurden in den hier vorgelegten Arbeiten (Anlage 1) zusätzlich in einem Tiermodell bestätigt. Nach subkutaner Injektion von A549-Zellen entwickelten Mäuse subkutane Tumoren am Injektionsort, wobei das Tumorwachstum nach LPS-Stimulation beschleunigt war und über einen Zeitraum von zwölf Tagen anhielt. Langzeitmodelle, in denen Mäuse repetitiven LPS-Inhalationen unterzogen wurden, bestätigen diese Befunde (97). Ebenso wurden die hier beschriebenen pro-proliferativen Effekte von LTA (Anlage 2) in einem Tiermodell reproduziert (84). Die Ligation des GPI-verankerten Glykoproteins CD14 initiiert die zelluläre Aktivierung durch LPS und LTA. An NSCLC-Zellen wurde zusätzlich die Rolle des „pattern recognition“-Rezeptors TLR4 für die durch LPS induzierte Tumorzellproliferation herausgearbeitet, während die durch LTA induzierten Effekte abhängig vom TLR2 waren (Anlagen 1, 2). Diese differenzielle Abhängigkeit spricht für die Spezifität der durch die jeweiligen Pathogenitätsfaktoren hervorgerufenen Proliferationsreaktionen. Auch in vivo scheint dem TLR-System eine pathogenetische Relevanz im NSCLC zuzukommen, da die Expression von TLR4 bzw. TLR2 im humanen Adenokarzinomgewebe jeweils mit einer negativen Prognose der Erkrankung vergesellschaftet ist (69, 70). Dazu passend zeigen aktuelle Untersuchungen, dass durch genetischen Knock-out von TLR2 und TLR4 in einem murinen Lungenkarzinommodel, die durch die Inflammation getriggerte Tumorpromotion unterbunden werden kann, was die Relevanz der hier dargestellten Befunde unterstreicht (85). Ebenfalls scheint der tumoreigene EGF-Rezeptor (EGFR) in die pro-proliferativen Effekte involviert zu sein, was durch die inhibierenden Effekte von Cetuximab, einem EGFR-Antikörper, auf die LPS-induzierte Zellproliferation belegt wurde. Vor dem Hintergrund der Evidenzen, dass der EGFR eventuell einen kritischen Ko-Rezeptor für Endotoxin darstellen könnte (92), lässt sich die Abhängigkeit der LPS-induzierten Tumorzellproliferation vom EGFR erklären. Dazu passend stellte sich die Strahlenresistenz, die in LPS-stimulierten NSCLC-Zellen induziert wurde, EGFR-abhängig dar (Anlage 3). Nach Bindung von LPS und LTA an die spezifischen TLRs kommt es zu einer Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren, wobei aufgrund ihrer Relevanz in vivo der Fokus auf die Cyclooxygenase (COX)-abhängigen Lipidmediatoren und das Chemokin IL-8 gelegt wurde. Die Stimulation von NSCLC-Zellen und humanem Lungenkarzinomgewebe mit LPS induziert eine Expression des Isoenzyms COX-2 (Anlage 1). Für dieses Enzym wird im Lungenkarzinom eine wesentliche pathogenetische Bedeutung postuliert, da die Expression im NSCLC gesteigert ist (34) und eine Korrelation zwischen Expressionsgrad und Prognose der Erkrankung existiert (35). In Anwesenheit eines COX-2-Inhibitors war der pro-proliferative Effekt von Endotoxin nahezu aufgehoben. Der entscheidende COX-2 Metabolit, der zur LPS-induzierten zellulären Proliferation führt, ist mit hoher Wahrscheinlichkeit PGE2, das in beträchtlichen Mengen in den Überständen LPS-stimulierter NSCLC-Zellen detektiert werden konnte. PGE2 stellt im Lungenkarzinomgewebe den quantitativ führenden Metaboliten der COX-2 dar (88) und könnte seine proliferativen Effekte über Aktivierung spezifischer PGE2-Rezeptoren ausüben, die im TME in vivo exprimiert sind (169). Voraussetzung für eine effektive Induktion der Synthese von PGE2 war die Präsenz des Cyclooxygenase-Substrates Arachidonsäure (AA). Im Tumormikromilieu des Lungenkarzinoms konnte freie AA nachgewiesen werden (87). Somit scheint die Substratsubstitution nicht artifiziell herbeigeführt, sondern vielmehr einem pathophysiologischen Mechanismus zu entsprechen. Neben den COX- und 5-LO-Produkten kommt auch den Zytokinen eine pathogenetische Rolle im Lungenkarzinom zu (24–29). IL-8 wurde in NSCLC-Zellen sowohl nach Stimulation mit LPS und LTA dosisabhängig induziert und sezerniert (Anlagen 2, 9). IL-8 scheint entscheidend an der TLR2-mediierten Tumorzellproliferation nach Stimulation mit LTA beteiligt zu sein, da dieser Mediator in den Zellüberständen nachgewiesen werden konnte, die IL-8-Sekretion durch Neutralisation von TLR2 attenuiert war, und eine Inhibition von IL-8 die pro-proliferativen Effekte von LTA aufhob (Anlage 2). Im Einklang hierzu übt IL-8 in verschiedenen Modellen des NSCLC pro-proliferative Effekte in vitro und in vivo aus, die über direkte Aktivierung der spezifischen Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2 mediiert werden können (26). Auch eine Kapazität zur Transaktivierung des EGFR wurde für IL-8 postuliert (12). Für die Relevanz dieses Chemokins in vivo spricht zudem die Korrelation des Expressionsgrades von IL-8 mit einer Tumorprogression im Lungenkarzinom (30). Ein möglicher therapeutischer Nutzen einer Antagonisierung von IL-8 wird in einer aktuellen klinischen Studie überprüft (180). Neutrophile Granulozyten stellen eine wesentliche Komponente des inflammatorischen Tumormikromilieus dar. Ihre Rekrutierung an einen pulmonalen infektiösen Fokus wird durch chemotaktische Substanzen wie IL-8 und Leukotrien (LT)B4 mediiert. Hierbei stellen die PMN selbst, einerseits durch ihre enzymatische Ausstattung mit Expression der 5-Lipoxygenase und andererseits über ihre quantitative Prädominanz, eine wesentliche zelluläre Quelle für diese chemotaktischen Substanzen dar. Obwohl es nach Stimulation von PMN mit LPS per se nicht zu einer Leukotriensynthese kommt (114), existiert ein CD14-abhängiger Priming-Effekt durch LPS, der eine Sensibilisierung der granulozytären Aktivierung durch einen zweiten Stimulus hervorruft (Anlage 7). So ist nach Endotoxin-Priming die durch das bakterielle Tripeptid fMLP induzierte Synthese von LTB4 und auch die Sauerstoffradikalfreisetzung isolierter PMN massiv amplifiziert. Solch autokrine Effekte von LTB4 wurden unter anderem in eigenen Untersuchungen bestätigt (124). Darüber hinaus kommt es nach Konfrontation isolierter PMN mit LPS oder LTA zu einer dosisabhängigen Freisetzung von IL-8 in den Zellüberstand (Anlagen 4–6). Diese ist bei beiden Pathogenen durch Ligation von CD14 mediiert (Anlagen 4, 6). Hier scheint auch eine Abhängigkeit der zellulären Aktivierung durch den Expressionsgrad der CD14-Rezeptoren zu bestehen, da gezeigt werden konnte, dass nach einer Heraufregulation von CD14 sowohl die LPS- als auch die LTA-induzierte Zytokinsynthese gesteigert war (Anlage 6). Die Membranexpression von CD14 ist kein stationäres Phänomen, sondern unterliegt einer Regulation durch Mobilisation aus intrazellulären Kompartimenten, die unter anderem durch LPS und LTA in PMN induziert werden kann (107, 108). In PMN zeigte sich die LPS-induzierte Synthese von IL-8 als abhängig von einer frühen Freisetzung von TNF und IL-1, wobei die durch LTA-induzierte Synthese von IL-8 ausschließlich durch TNF mediiert schien. Neben diesen mechanistischen Divergenzen unterschieden sich die durch LPS und LTA induzierte Zytokinsynthese insofern, als weitaus höhere Konzentrationen von LTA zur Induktion einer quantitativ vergleichbaren Zytokinsynthese notwendig waren. Das niedrigere immunogene Potenzial von LTA versus LPS wurde bereits beschrieben (105). Interessanterweise unterliegt die LPS-induzierte granulozytäre Synthese von IL-8 einer Autoregulation in Abhängigkeit von der Zelldichte, wobei eine Erhöhung der Zelldichte mit einer Abnahme der Sekretion von IL-8 einherging (Anlage 5). Die Inhibition der Chemokinsynthese wird durch überproportional freigesetzte Mengen löslicher TNF-Rezeptoren und des IL-1-Rezeptorantagonisten mediiert. Angesichts der weitaus niedrigeren Rezeptoraffinität der löslichen Zytokin-Rezeptorantagonisten gegenüber den Liganden IL-1 und TNF könnte dieser Überschuss einem physiologischen Mechanismus entsprechen (132, 133). Diese Autoregulation könnte einer exzessiven Granulozytenakkumulation und Aktivierung in einem infektiösen Fokus vorbeugen. In Interaktion mit NSCLC-Zellen zeigt sich die Synthese von IL-8 keinesfalls limitiert. Im Gegenteil war diese in LPS-stimulierten Ko-Kulturen von PMN und NSCLC-Zellen massiv amplifiziert (Anlage 8). Somit können im inflammatorischen Tumormikromileu unter dem Einfluss bakterieller Pathogenitätsfaktoren große Mengen dieses pathogenetisch relevanten Chemokins entstehen. Der amplifizierende Effekt der Ko-Kulturen auf die Zytokinsynthese konnte an A549-Zellen auch nach Stimulation mit Lipoteichonsäuren beobachtet werden und wurde in der SCLC-Zelllinie H69 reproduziert. Die amplifizierte IL-8-Synthese war, wie schon zuvor in den Monokulturen an PMN beschrieben, partiell durch autokrin sezerniertes TNF bedingt, da die Neutralisation von TNF eine Verringerung der IL-8-Spiegel in den Zellüberständen der Ko-Kulturen bewirkte. Hier könnte das von PMN sezernierte TNF parakrin die Synthese von IL-8 in A549-Zellen stimulieren, die den TNFRI exprimieren (140). Auch COX-abhängige Mediatoren trugen zur Amplifizierung der Synthese von IL-8 bei. Dazu passend wurde bereits eine Korrelation der COX-2-Aktivität mit der Synthese von IL-8 in humanen NSCLC-Zelllinien beschrieben (142). Interessanterweise induzierte die Interaktion von PMN und NSCLC-Zellen eine Steigerung der Proliferation der Lungenkarzinomzellen (Anlage 9). Dieser Effekt war ebenfalls durch COX-abhängige Mediatoren der Arachidonsäure vermittelt, da die gesteigerte Proliferation durch Inhibitoren der COX, insbesondere des Isoenzyms COX-2, attenuiert werden konnte. Im Einklang dazu wurde eine massive, COX-2-abhängige Amplifikation der LPS-induzierten Freisetzung von PGE2 in den Ko-Kulturen im Vergleich zu Monokulturen von NSCLC-Zellen verzeichnet. Diesem Phänomen könnte ein transzellulärer Lipidmediator-Metabolismus, der durch den wechselseitigen Austausch von Substraten und Produkten gekennzeichnet ist, zugrunde liegen (32). Auch die neutrophile Elastase war in die pro-proliferativen Effekte der PMN involviert. In den Überständen von PMN, die in Gegenwart humaner NSCLC-Zellen kultiviert wurden, war die Sekretion von Elastase im Vergleich zu Monokulturen von PMN mehr als verdoppelt. Darüber hinaus attenuierte pharmakologische Inhibition der Elastase die PMN-abhängige Proliferationssteigerung in NSCLC nahezu auf Normalniveau. In-vivo-Studien bestätigen, dass diese Serinprotease ebenfalls die Kapazität zur Induktion eines pro-proliferativen Signaltransduktion unter anderem durch Aktivierung von EGFR besitzt (53, 156). Zusammenfassend induzieren bakterielle Pathogenitätsfaktoren an diversen Modellen des NSCLC eine Tumorproliferation und Therapieresistenz. Hierbei spielt sowohl die direkte Aktivierung tumoreigener, pro-proliferativer Mechanismen, wie die Stimulation von TLRs und des EGFR, eine Rolle. Des Weiteren ist die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten als wichtige zelluläre Komponenten des Tumormikromilieus in Mono- und Ko-Kultur-Systemen in die Tumorzellproliferation involviert. Entscheidende humorale Effektoren, die über auto- und parakrine Mechanismen die Tumorzellproliferation bedingen, stellen inflammatorische Mediatoren dar, wobei in den vorliegenden Untersuchungen Schlüsselrollen insbesondere für COX 2-abhängige Lipidmediatoren, IL-8 sowie die neutrophile Elastase identifiziert wurden. Die inflammatorische Tumorprogression ist ein multifaktorielles, differenziell reguliertes Geschehen, wobei einige der involvierten inflammatorischen Mechanismen Ansätze für innovative Therapieansätze des NSCLC bieten könnten und bereits in klinischer Erprobung sind.