Activin receptor-like kinase 1 is a novel regulator of collagen deposition in idiopathic pulmonary fibrosis

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive and fatal lung disease of unknown origin, characterised by alveolar epithelial cell damage, increased deposition of extracellular matrix (ECM) in the lung interstitium, enhanced fibroblast/myofibroblast proliferation and activation, which ultimately leads to the distortion of normal lung architecture and loss of respiratory function. The interstitial fibroblast/myofibroblast represents the key effector cell responsible for the increased ECM deposition characteristic of IPF. Fibroblasts secrete large amounts of fibrillar collagens, which are the key ECM proteins, which exhibit elevated expression in this disease. The TGF-beta is the primary and most potent profibrotic mediator involved in fibroblast activation and differentiation, and subsequent collagen production and deposition. Thus, it was hypothesised that the expression of TGF-beta system components is altered in IPF, ultimately affecting the fibroblast activation and collagen synthesis.In this study, the expression levels of ALK1, ALK5, TGF-betaRII and endoglin, as well as Smads and TGF-beta target genes, were analysed in the context of human pulmonary fibrosis. The expression of ALK1 was significantly downregulated in human lung homogenates from fibrotic lungs when compared to those from healthy subjects. Expression of other TGF-beta system components was not altered in the disease. Furthermore, ALK1 and ALK5 mRNA and protein expression was localised to epithelial cells, endothelial cells, smooth muscle cells and fibroblasts, and the expression of ALK1 and ALK5 was decreased in primary fibroblasts isolated from human fibrotic lung tissue, compared to healthy controls, as assessed by quantitative RT-PCR and immunohistochemistry. The human fibroblast cell lines HFL1 and IMR-90 were selected for functional assays because these cell lines express TGF-beta system components, and demonstrate active TGF-beta and BMP signalling characterised by the phosphorylation of Smad2/3 and Smad1/5/8, respectively. Finally, treatment of human lung fibroblast cell lines with the siRNA specific for ALK1 attenuated collagen deposition, which was rescued by TGF-beta1 stimulation. However, the impact of ALK1 on fibroblast activation and collagen deposition may not be primary, as the other signalling pathways might be involved.These results demonstrated that ALK1 was expressed and functional in lung fibroblasts. The lack of ALK1 might be involved in the activation of fibroblasts thus leading to the collagen production, therefore being involved in the pathogenesis of pulmonary fibrosis. Die idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) ist eine fortschreitende und tödlich verlaufende Lungenerkrankung mit unbekanntem Ursprung, charakterisiert durch geschädigte Alveolarepithelzellen, gesteigerte Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM) im Lungeninterstitium, erhöhte Fibroblasten/Myofibroblastenproliferation und -aktivierung, welche letztendlich zu einer Verformung der normalen Lungenstruktur und dem Verlust der respiratorischen Funktion führt. Der interstitielle Fibroblast/Myofibroblast repräsentiert die Schlüsseleffektorzelle, welche für die gesteigerte ECM-Ablagerung verantwortlich ist und somit charakteristisch für eine IPF.Fibroblasten sekretieren große Mengen von fibrillären Kollagenen, welche die Schlüsselproteine der ECM sind, was auch durch ihre gesteigerte Expression in dieser Erkrankung belegt wird. TGF-beta ist der primäre und stärkste profibrotische Mediator, der an der Fibroblastenaktivierung und Differenzierung sowie der anschließenden Kollagenproduktion und Ablagerung beteiligt ist. Folglich war anzunehmen, dass die Expression von TGF-beta Komponenten in IPF verändert ist, letztlich wirken Fibroblastenaktivierung und Kollagensynthese.In dieser Studie wurde das Expressionsniveau von ALK1, ALK5, TGF-betaRII und Endoglin, ebenso wie das der Smads und TGF-beta Zielgene im Zusammenhang mit der humanen pulmonalen Fibrose untersucht. Die Expression von ALK1 war in humanen Lungenhomogenaten von fibrotischen Lungen im Vergleich zu gesunden Lungen signifikant herunterreguliert. Die Expression von anderen TGF-beta Komponenten war in dieser Krankheit unverändert. Darüber hinaus war die ALK1 und ALK5 mRNA und Proteinexpression in Epithelzellen, Endothelzellen, glatten Muskelzellen und Fibroblasten lokalisiert. Die Expression von ALK1 und ALK5, die mit Hilfe quantitativer RT-PCR und Immunhistochemie ermittelt wurde, war in primären Fibroblasten, welche aus humanem fibrotischen Lungengewebe isoliert wurden, im Vergleich zu gesunden Kontrollen geringer. Für funktionelle Untersuchungen wurden die humanen Fibroblastenzelllinien HFL1 und IMR-90 ausgewählt, da diese Zelllinien Komponenten des TGF-beta Signalweges exprimieren und aktive TGF-beta und BMP Signaltransduktion, charakterisiert durch die jeweilige Phosphorylierung von Smad2/3 und Smad1/5/8, aufzeigen. Die Behandlung von humanen pulmonalen Fibroblastenzelllinien mit der spezifischen siRNA für ALK1 verringerte die Kollagenablagerung, welche durch eine TGF- beta Stimulation hervorgerufen wurde. Dennoch dürfte der Einfluss von ALK1 auf die Fibroblastenaktivierung und Kollagenablagerung nicht der wichtigste sein, da auch andere Signalwege involviert sein könnten.Diese Ergebnisse zeigten, dass ALK1 in Lungenfibroblasten exprimiert wird und funktionell ist. Ein Mangel von ALK1 könnte in die Fibroblastenaktivierung involviert sein und dadurch zur Kollagenproduktion führen, demzufolge kann ALK1 an der Pathogenese der pulmonalen Fibrose beteiligt sein.