Einfluss des Rho/ROCK-Signalweges auf die TGF-β3-induzierte tenogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen

Abstract

Mesenchymale Stromazellen (MSC) sind ein vielversprechendes therapeutisches Mittel zur Behandlung von Sehnenerkrankungen. Ihre tenogene Differenzierung ist für Tissue-Engineering-Ansätze von entscheidender Bedeutung und kann ihre positive Wirkung nach Zelltransplantation in vivo unterstützen. Der transformierende Wachstumsfaktor (TGF)-β, der über intrazelluläre Smad-Moleküle signalisiert, ist ein potenter parakriner Mediator der tenogenen Differenzierung. Darüber hinaus induzieren die extrazelluläre Matrix oder zyklische Dehnung die Tenogenese über die Aktivierung des Rho/ROCK-Signalweges, der jedoch auch an fehlerhaften Anpassungen bei Pathologien der extrazellulären Matrix beteiligt ist. Demnach ist die Rolle des Rho/ROCK-Signalwegs noch nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass die Rho/ROCK-Aktivität die Phosphorylierung von Smad2/3 und damit die tenogene Differenzierung beeinflusst. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Beeinflussung der TGF-β-induzierten tenogenen Differenzierung durch Rho/ROCK besser zu verstehen und die dem zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu beleuchten. Insbesondere Smad2/3 wird als mögliche Schnittstelle des Crosstalk zwischen den beiden Signalkaskaden betrachtet. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit ist der Vergleich der klinisch wichtigen Spezies Pferd und Mensch, um eine Grundlage für eine spätere Translation der Ergebnisse experimenteller In-vitro- und In-vivo-Studien zu schaffen. In der ersten Studie wurden MSC aus humanem und equinem Fettgewebe isoliert und als Monolayer oder auf dezellularisierten Sehnenscaffolds kultiviert, um den Einfluss des ROCK-Inhibitors Y-27632 auf die TGF-β3-induzierte tenogene Differenzierung zu untersuchen. Die MSC wurden mit und ohne TGF-β3 (10 ng/ml), Y-27632 (10 μM) oder beiden Reagenzien inkubiert. An Tag 1 und 3 Tag wurden der TGF-β-Signalweg und das Aktinzytoskelett durch Smad2/3- und Phalloidin-Färbung visualisiert und die Genexpression von Signalmolekülen und Sehnenmarkern untersucht. In der zweiten Studie wurden ausschließlich humane MSC verwendet und das Sehnenscaffold durch eine Kollagen-I-Matrix ersetzt. Die Stimulation mit TGF-β und Y-27632, sowie die Kontrolle der Wirksamkeit des ROCK-Inhibitors mittels Phalloidin-Färbung erfolgten analog zur ersten Studie. Die Genexpression von tenogenen Markern und einem erweiterten Set an Signalmolekülen wurden ebenfalls am Tag 1 und 3 nach Stimulation analysiert. Zusätzlich erfolgte die Analyse der Phosphorylierungsstellen des Smad2 und Smad3 mittels Western Blot zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation. Die Ergebnisse zeigen, dass TGF-β3 den Smad2/3-Signalweg durch carboxy-terminale Phosphorylierung aktiviert, die Smad2/3-Kerntranslokalisation induziert und schließlich die Genexpression tenogener Marker steigert. Die Hemmung des Rho/ROCK-Signalwegs durch Y-27632 verstärkte die TGF-β3-induzierte Smad2/3-Kerntranslokalisation zusätzlich (p < 0,05 bei equinen MSC) und führte zu einer weiteren Erhöhung der Expression von Skleraxis (p < 0,05 bei humanen MSC). Die ROCK-Hemmung wurde in beiden Studien durch eine Zerstörung des Aktinzytoskeletts bestätigt. In der zweiten Studie wurde nachgewiesen, dass die ROCK-Hemmung die Smad2-Linker-Phosphorylierung nicht beeinflusste, jedoch zeigten Monolayerexperimente Hinweise auf eine mögliche Phosphorylierung der Linkerregion von Smad3. Auch die Kultivierung der MSC auf dem Sehnenscaffold und der Kollagenmatrix förderte die Wirkung von TGF-β3. Hierbei wurde eine Reduktion der Smad2-Linker-Phosphorylierung durch die Kultivierung auf Kollagenmatrizen, aber nicht durch ROCK-Inhibition festgestellt. Dementsprechend scheint die Scaffold-Wirkung entgegen der bisherigen Annahme nicht vollständig Rho/ROCK vermittelt zu sein. Dies wird durch die Ergebnisse, die keine gesteigerte ROCK-Aktivität auf der Kollagenmatrix nachwiesen, unterstützt. Darüber hinaus zeigte die Arbeit, dass humane und equine MSC ähnlich auf die kombinierte Behandlung mit TGF-β3 und Y 27632 reagieren, was auf eine konservierte Signaltransduktion hindeutet. Jedoch wiesen die Regulierungsmuster der Signalmoleküle TGF-β3 und Smad8 Unterschiede zwischen humanen und equinen MSC auf. Zusammengenommen können die Kultivierung auf Scaffolds und der Rho/ROCK-Signalweg den TGFβ3/Smad2/3-Signalweg beeinflussen, indem sie verschiedene Phosphorylierungsstellen der Smad-Linker-Region regulieren. Folglich scheint die Rho/ROCK-Inhibition eine vielversprechende Strategie darzustellen, um die TGF-β3-induzierte tenogene Differenzierung von MSCs zu fördern.