Untersuchungen zur Immunogenität verschiedener äußerer Membranproteine von Brachyspira hyodysenteriae im Zellkultur-Adhärenz-Modell
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Zusammenfassung
Die Schweinedysenterie ist eine durch Brachyspira (B.) hyodysenteriae verursachte mukohämorrhagische Diarrhö, die weltweit große wirtschaftliche Bedeutung besitzt. Habitat des Erregers ist der Dickdarm. Hilfestellung für die dauerhafte Besiedlung dieses Darmabschnitts könnte von Erreger-Wirtszell-Interaktionen ausgehen, die sich bei in vitro Versuchen in einer Adhärenz der Brachyspiren an Epithelzellen darstellen. Vermittler dieser Adhärenz sind nach ihrer exponierten Lage in der Zellwand der Bakterien zu urteilen äußere Membranproteine (OMP) der Brachyspiren. Diese Hypothese war Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit. Es war zu beantworten, ob Brachyspiren an Säugerzellkulturen, insbesondere an Darmepithelzellen vom Schwein, adhärieren und ob Antikörper gegen OMPs von B. hyodysenteriae diese Adhärenz inhibieren können. Weiterhin sollte an Untersuchungen mit verschiedenen Serotypen von B. hyodysenteriae geklärt werden, ob die verwendeten OMPs serologisch einheitlich sind und ob die Inhibierung der Anheftung als serotypübergreifend oder eher als serotypspezifisch zu charakterisieren ist.Die OMPs von B. hyodysenteriae Stamm B204 mit den Bezeichnungen Bhlp16, Bhlp29,7d, Bhmp39f und Bhmp39h wurden in E. coli BLR(DE3) kloniert und nach Expression affinitätschromatographisch gereinigt. Zur Herstellung rOMP-spezifischer Antiseren (Anti-rOMP) wurden Kaninchen in Intervallen von jeweils 1-2 Wochen zweimalig subkutan und dreimalig intravenös immunisiert. Die 1 Woche nach der letzten Antigenapplikation gewonnenen Seren wurden mittels SDS-PAGE und Immunoblot auf Reaktivität gegenüber den rOMPs und den entsprechenden Proteinen in den Ganzzelllysaten der Serotyp-Referenzstämme geprüft. Versuche zur Prüfung der Inhibition der Adhäsion der verschiedenen B. hyodysenteriae Serotypen erfolgten im Zellkulturadhärenzmodell (s. u.). Zur Prüfung der Adhärenz der Brachyspiren an Kulturzellen dienten verschiedene Darmepithelzelllinien wie IEC-18- (Ratte), IPEC-J2- (Schwein) und HRT-18-Zellen (Mensch). Vermehrungsfähige Brachyspiren in Nährbouillon wurden auf den mit BHI gewaschenen Zellrasen pipettiert und nach zweistündiger Inkubation und dreimaliger Waschung mit PBS die an den Zellen haftenden Bakterien durch Immunfluoreszenzfärbung detektiert und quantifiziert. Adhärenzhemmversuche erfolgten nach vorhergehender 20 minütiger Inkubation der Brachyspirensuspension mit dem fraglichen Antiserum, bzw. einer Ultraschallpräparation aus Kulturzellen in analoger Weise.Die mit den verschiedenen rOMPs immunisierten Kaninchen bildeten jeweils spätestens nach dreimaliger Antigenapplikation im Immunoblot detektierbare Antikörper gegen die verwendeten Antigene. Bis auf Bhlp16 bei Stamm B8044, der nach eigenen molekularbiologischen Untersuchungen nicht über das entsprechende Protein verfügte, erkannten die Antiseren Proteine im jeweils erwartenden Größenbereich in Ganzzelllysaten aller 9 Serotyp-Referenzstämme.Im Rahmen der zellbiologischen Experimente adhärierten die Brachyspiren sowohl an IEC-18- als auch an IPEC-J2-Zellen, nicht jedoch an die humanen HRT-18-Zellen. Die Adhäsion war sowohl durch Serum von rekonvaleszenten Schweinen, als auch durch Ultraschalllysate entsprechender Zellen hemmbar. Die Verwendung der rOMP-spezifischen Antiseren reduzierte im Zellkulturadhärenzmodell mit IPEC-J2-Zellen die Adhäsion des Spenderstamms in unterschiedlichem Ausmaß. Bei Prüfung aller möglichen Serumkombinationen wiesen jene die höchsten Hemmeffekte auf, die Anti-rBhlp16 und Anti-rBhmp39f enthielten. Unter Verwendung einer Mischung aus diesen beiden Antiseren war eine Inhibition der Adhäsion von allen 9 B. hyodysenteriae Serotypen möglich. Die Adhäsionsreduktion reichte von 53 % bis 91 %.Aus den Versuchen der vorliegenden Arbeit wird abgeleitet, dass B. hyodysenteriae-Stämme spezifisch an animale Darmepithelzelllen adhärieren können und dass an dieser Adhärenz äußere Membranproteine (OMP) von B. hyodysenteriae mitbeteiligt sind. Die untersuchten OMPs erwiesen sich als serologisch einheitlich. Gleichzeitig waren Antikörper gegen diese OMPs in der Lage, die Adhärenz der Bakterien an die Zellkulturen serotypübergreifend zu inhibieren. Nach aller Wahrscheinlichkeit wird die Adhärenz aber nicht nur von einem Protein vermittelt. Sie ist eher als Folge der additiven Wirkung mehrerer Proteine anzusehen. Hierbei haben Bhlp16 und Bhmp39f nach den vorliegenden Untersuchungen jedoch einen besonderen Anteil.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2009