Herstellung von kaninem Interleukin-2 (cIL-2) nach stabiler Transfektion der mesenchymalen BHK-Zelllinie mit Hilfe des Tet-on-Expressionssystems zur Erzeugung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) für eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund
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Zusammenfassung
1. Der Literaturteil gibt zunächst eine kurze Übersicht über die Möglichkeiten der Immuntherapie und der adoptiven Immuntherapie von Tumoren beim Menschen undbeim Hund, wobei insbesondere auf eine Anwendung von Interleukin-2 (IL-2) undden Einsatz von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) eingegangen wird.Ziel dieser Arbeit war es nämlich, die mesenchymale Zelllinie BHK mitmolekularbiologischen Methoden (Tet-on-System) so zu verändern, dass sie in derLage ist, biologisch aktives IL-2 vom Hund (cIL-2) kontinuierlich zu produzieren. Dieses soll dann für eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund für die klinische Anwendung zur Verfügung gestellt werden. 2. Dazu wurde zunächst eine cDNA für cIL-2 aus mit Percoll® isolierten, Con Astimulierten Hundeblutlymphozyten in einer RT-PCR gemäß der Publikation vonDunham et al. (1995) amplifiziert. Die Sequenzierung der gewonnenen cDNA ergabeine hundertprozentige Übereinstimmung mit der publizierten Sequenz (Dunham etal., 1995). 3. Die Expression des cIL-2-Proteins sollte in BHK-Zellen durch das Tet-on-Expressionssystem gesteuert werden. Dazu musste die cIL-2-cDNA zusammen mitdem Reportergen Luciferase in das Response-Plasmid pTRUE eingebaut werden. Diesgelang, indem zunächst Schnittstellen für Restriktionsenzyme flankierend zumkodierenden Bereich in die cIL-2-cDNA eingebaut und durchRestriktionsenzymverdau Überhänge mit sogenannten "Sticky Ends" produziertwurden. Die erneute Sequenzierung der cIL-2-Sequenz ergab wiederum eine totaleÜbereinstimmung zur von Dunham et al. (1995) publizierten Sequenz. Nachdem dasResponse-Plasmid pTRUE und das Luciferase-Gen ebenfalls mit Restriktionsenzymengeschnitten und so mit "Sticky Ends" versehen worden waren, erfolgte derZusammenbau dieser Elemente in einer Dreifachligation zu dem Response-PlasmidpTRUE-IL-2. 4. Anschließend wurde eine transiente Transfektion des Response-Plasmids pTRUE-IL-2in BHK-Tet-on-Zellen durchgeführt und die Aktivität des Reportergens überprüft.Hierbei konnte nach der Induktion des Tet-on-Systems mit Doxyzyklin eine um etwadas Tausendfache gesteigerte Aktivität der Luciferase gemessen werden. 5. Nach der stabilen Transfektion von pTRUE-IL-2 in BHK-Tet-on-Zellen wurden 12Klone auf die Expression von Luciferase untersucht. 11 davon zeigten eineInduzierbarkeit mit Stimulationsindizes von 2,6 bis 46,8. Bei einer Klon-Linie (A11)wurde ein inverses Verhalten festgestellt. Sie wies induziert eine geringere Luciferase-Expression auf als im nicht induzierten Versuchsansatz. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt allerdings unklar. Weitere Luciferase-Assays auch von reklonierten BHK-Linien bestätigten die Induzierbarkeit des Tet-on-Systems nach der stabilen Transfektion. Die Existenz der mRNA für cIL-2 in den transfizierten BHKKlonen wurde anschließend in einer RT-PCR nachgewiesen. 6. Weiterhin wurde überprüft, ob nicht-transfizierte, native BHK-Zellen eventuell Faktoren abgeben, die die Aktivität von Effektorzellen mit spontaner zytotoxischer Aktivität stimulieren oder blockieren. Dazu wurden Lymphozyten unter Anreicherung von NK-Zellen aus Hundeblut über einen 57,5 %igen Percoll®-Gradienten isoliert, in den Überständen von nativen BHK-Zellen inkubiert und ihre zytotoxische Aktivität in einem kolorimetrischen Farbstofftest, dem Rose Bengal Assay (RBA), gemessen. Durch die Behandlung mit diesen Überständen war keine Veränderung der zytotoxischen Aktivität nachweisbar. 7. Für den Nachweis der biologischen Aktivität des von den transfizierten BHK-Zellen sezernierten cIL-2 wurden Bioassays mit der IL-2-sensitiven Zelllinie CTLL-2 durchgeführt. Bei allen untersuchten BHK-Klonen war eine Produktion von biologisch aktivem cIL-2 nachweisbar. Die Menge des im induzierten Zustand sezernierten cIL-2 ließ sich jedoch schwer bestimmen, da die cIL-2-Produktion je nach Kulturbedingungen (Inkubationsdauer, Zellkonzentration der eingesetzten Klone) stark schwankte. Bei allen Klonen war eine basale cIL-2-Sekretion im nicht induzierten Zustand nachweisbar. Unter serumfreien Bedingungen ließ sich die Produktion von cIL-2 durch die Zugabe von Doxyzyklin nicht induzieren. Unterschiedliche induzierende Doxyzyklin-Konzentrationen von 0,5 bis 5 myg/ml ergaben cIL-2-Konzentrationen, die den Verlaufeiner Dosis-Wirkungskurve mit einem Optimum bei 1 myg/ml aufweisen. Mit derniedrigsten (0,1 myg/ml) und höchsten (10 myg/ml) untersuchten Doxyzyklin-Konzentration konnte hingegen jeweils eine nur schwache Induktion der cIL-2-Produktion erzielt werden. 8. Diese cIL-2 produzierenden BHK-Klone sollen im Rahmen der klinischenAnwendung für die in vitro-Stimulation von LAK-Zellen durch Koinkubation mitangereicherten NK-Zellen von Tumorpatienten in einem kommerziell erhältlichenBioreaktorsystem eingesetzt werden, welches ursprünglich für die einfacheHerstellung monoklonaler Antikörper konstruiert worden war. In einem solchenSystem können beide Zellarten durch eine semipermeable Membran voneinandergetrennt inkubiert werden. cIL-2 kann die Membran durchdringen und so einekontinuierliche Stimulation zu LAK hervorrufen, während ein direkter Zell-Zell-Kontakt verhindert wird. Die IL-2-Gabe in Intervallen und die damit verbundene stark schwankende IL-2-Konzentration im Kulturmedium wie bei den bisherigenKultursystemen wird dadurch vermieden. Die auf diese Weise erzeugten LAK sollenin einer adoptiven Tumorimmuntherapie beim Hund eingesetzt werden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008