Immunologische Analyse der postakuten Entzündungsphase einer Klebsiella pneumoniae induzierten Pneumonie unter dem Einsatz von prospektiv definierten mesenchymalen Stammzellen zur experimentellen Therapie

Abstract

HintergrundIn zahlreichen Studien wurde das immunmodulatorische Potential von mesenchymalen Stammzellen (MSC) untersucht. Jedoch verwenden die meisten Arbeiten heterogene Stammzellkulturen, was eine starke Einschränkung der Vergleichbarkeit verschiedener Studien zur Folge hat. Für die Versuche dieser Arbeit wurden die MSCs vor der in vitro Expansion prospektiv durch ein definiertes Oberflächenprofil hochrein sortiert. (Reinheit>95%). Nosokomiale Pneumonien mit antibiotikaresistenten Errregern, wie Klebsiella pneumonia stellen ein zunehmendes medizinisches Problem dar, für das dringend neue therapeutische Alternativen entwickelt werden müssen.MethodenZur Gewinnung von murinen MSCs wurden Humerus, Tibia und Femur von Mäusen präpariert. Definiert durch die Oberflächenmerkmale PDFGRa+ SCA1+ CD45− TER119−, wurden die MSCs mit einer Reinheit von mindestens 95% von allen anderen Knochenmarkzellen getrennt. In einem Mausmodell wurde eine Klebsiellenpneumonie induziert und vier Stunden nach der Infektion MSCs appliziert. Nach fünf Tagen wurden die Tiere euthanasiert, Organmaterial entnommen und untersucht.ErgebnisseEs zeigte sich bei den Mäusen der Gruppe, die nach Infektion MSCs erhielten gegenüber der lediglich infizierten Kontrollgruppe, eine verminderte Bakterienlast und eine signifikante Reduktion des Proteingehalts der bronchoalveolären Lavage. Ferner wurde eine signifikant geringere Leukozytose beobachtet. Alle untersuchten Subpopulationen dendritischer Zellen waren gegenüber der infizierten Kontrollgruppe ohne MSCs Applikation signifikant vermindert. Zudem wurde die lymphozytäre Zytokinproduktion durch die Gabe von MSCs reduziert. Signifikant zeigte sich dies bei der Produktion von IFN-γ durch CD4+ und CD8+ Zellen und der Produktion von IL-17 durch CD4+ Zellen.DiskussionDie Ergebnisse lassen auf eine durch die Applikation von MSCs weniger ausgeprägte Entzündungsreaktion schließen. Der reduzierte bronchoalveoläre Proteingehalt lässt Rückschlüsse auf ein geringeres Kapillarleck und somit einen besseren Erhalt der Blutluftschranke zu. Allein durch eine mögliche immunsuppressive Wirkung der MSCs lässt sich die reduzierte Bakterienlast nicht erklären, da ein immunsupprimiertes Milieugünstigere Bedingungen für ein bakterielles Wachstum darstellt. Neue Studien haben in verschiedenen Ansätzen gezeigt, dass MSCs direkt antibakteriell wirken können. Es kann angenommen werden, dass diese Wirkung auch in dem für diese Dissertation verwendeten Mausmodell zur Reduktion der Bakterienlast beiträgt.In Bezug auf die Reduktion der Leukozytose, verschiedener Subpopulationen dendritischer Zellen und der Zytokinproduktion von Lymphozyten konnten in der Literatur beschriebene Eigenschaften von MSCs für diese prospektiv sortierte Kultur von MSCs weitestgehend bestätigt werden.AusblickAufgrund stetiger Resistenzentwicklung gewinnen Alternativen zu Antibiotika bei der Therapie von Infektionen immer weiter an Bedeutung. In verschiedenen Studien wurden die Auswirkungen von MSCs auf eine bakterielle Pneumonie mit unterschiedlichen Erregern untersucht. In den Versuchen zu dieser Dissertation konnte erstmals gezeigt werden, dass sich die Ergebnisse einer unter MSC Applikation weniger stark ausgeprägten Pneumonie auf eine Klebsiellen Pneumonie übertragen lassen. Es besteht zum aktuellen Zeitpunkt weiterer Forschungsbedarf bezüglich der Faktoren, welche für die therapeutische Wirkung von MSCs in einer Pneumonie verantwortlich sind. Ein mögliches Ziel ist die Etablierung der MSC-Therapie bei antibiotikaresistenten Pneumonien im Sinne der evidenzbasierten Medizin. BackgroundIn numerous studies the immunosuppressive potential of mesenchymal stem cells (MSC) has been analyzed. However, almost all studies use heterogenic cultures of progenitor cells. Therefore the comparability of these studies is strongly limited. For the experiments of this thesis the MSCs where sorted before expansion prospectively on the basis of PDFGRa+ SCA1+ CD45− TER119−expression and a culture of over 95% purity was reached. Nosocomial pneumonias with antibiotic resistant bacteria like Klebsiella pneumonia are an increasing medical problem, for which therapeutic alternatives have to be developed.MethodsTo gain MSCs murine humerus, tibia and femur of mice were prepared. On the basis of PDFGRa+ SCA1+ CD45− TER119− expression, the MSCs were sorted and cultured with a purity of at least 95%. In a mouse model pneumonia was induced with Klebsiella pneumoniae. The MSCs were applied four hours after infection. After five days the mice were killed, organ material was taken and analyzed.ResultsBacterial load was reduced and the protein content of the BAL was significantly reduced comparing the MSC treated mice to the mock treated control group. Also the leukocytosis was significantly reduced. All examined dendritic cell subsets were significantly reduced compared to the mock treated group. The reduction of lymphocytic cytokine production showed significant results for IFN-γ in CD4+ and CD8+ cells and IL-17 in CD4+ cells.ConclusionThe results imply a weaker inflammation due to MSC treatment. The reduced protein content in the BAL allows the conclusion that there is a smaller capillary leak which means the integrity of the blood air barrier is impaired less. The reduced bacterial load cannot be explained by the possible immunosuppressive effect of the MSCs. An immunosuppressed milieu would prevail better conditions for bacterial growth. New studies showed that MSCs have a direct antimicrobial effect. This can explain the reduction of bacterial load in this thesis.The reduction of leukocytosis, the dendritic cell subsets and cytokine production are in literature described as characteristics of MSCs and could be confirmed for this special prospectively sorted population of MSCs.Future perspectiveDue to fast developing resistances alternatives to antibiotic treatments gain more and more importance to face infections. Different studies described the effect of MSC treatment in bacterial pneumonia with varying germs. This study showed for the first time that the results of a less severe pneumonia can be transferred to Klebsiella pneumonia. Further research is needed concerning the mechanisms how MSCs effect a pneumonia. One possible goal could be the establishment of MSC therapy in antibiotic-resistant pneumonia in terms of evidence-based medicine.