Untersuchungen zum kulturellen und molekularbiologischen Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) aus humanen Darmbioptaten

Abstract

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose der Wiederkäuer. Bereits seit Anfang des letzten Jahrhunderts wird aufgrund der pathomorphologischen Ähnlichkeiten ein ursächlicher Zusammenhang mit Morbus Crohn (MC), einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung des Menschen, vermutet und seitdem kontrovers diskutiert. Für Milchrinderbestände werden in einzelnen Bundesländern Seroprävalenzdaten für Paratuberkulose von bis zu ca. 80 % angegeben. Abgesehen von einer Erregerübertragung durch direkten Tierkontakt und der weiten Verbreitung des Erregers in der Umwelt, werden Lebensmittel als mögliche Vehikel diskutiert. In zahlreichen Studien wurde MAP-Desoxyribonukleinsäure im Darmgewebe von MC-Patienten und Kontrollen nachgewiesen. Nur in wenigen Untersuchungen wurde parallel die kulturelle Überprüfung der Vermehrungsfähigkeit durchgeführt. Zudem mangelt es den Polymerase-chain-reaction (PCR)-Verfahren an einer diagnostischen Qualitätssicherung mit interner Amplifikationskontrolle (IAK) und die gewählten Marker weisen Kreuzreaktionen mit anderen Mykobakterienspezies auf. In den eigenen Arbeiten wurde daher die kulturelle Anzüchtung unter Einsatz eines zuvor eigens validierten Dekontaminationsverfahrens unter Verwendung von N-Acetyl-L-Cystein-NaOH mit der PCR-Analytik kombiniert. Um die Zuverlässigkeit der Nachweisverfahren zu steigern, wurde eine nested PCR und eine kürzlich entwickelte Triplex Real Time-PCR (SCHÖNENBRÜCHER et al., 2008) inklusive einer internen Amplifikationskontrolle verwendet. So wurden erstmals die drei MAP-spezifischen Marker IS900, ISMav2 und F57 bei humanen Darmbioptaten diagnostisch kombiniert. Für die spätere Subkultivierung und Archivierung der MAP-Stämme wurden in einer vergleichenden Untersuchung preiswerte, einfach zu handhabende und produktive Selektivmedien ermittelt. Es konnten insgesamt 120 Proben von 32 Probanden berücksichtigt werden. Darunter befanden sich Bioptate von 12 MC- und acht Colitis ulcerosa (CU)-Patienten sowie 12 Kontrollprobanden, die nicht an einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung leiden. Darunter erwiesen sich Anreicherungskulturen von vier (33,3 %) MC- und zwei (25,0 %) CU-Patienten sowie von neun (75,0 %) Kontrollprobanden (p = 0,059) als molekularbiologisch MAP-positiv. Die Subkultivierung und Isolierung von MAP gelang aus dem Colon transversum einer Kontrollperson. Bei zwei Colitis ulcerosa-Patienten und einer Kontrollperson konnten vermehrungsfähige Mycobacterium avium ssp. avium-Stämme isoliert werden. Alle Isolate wurden mittels Sequenzanalyse der 16S-ribosomalen RNA (ribonucleic acid) und der 16S-23S intragenic spacer region (ITS) bestätigt und für die institutseigene Mykobakterienstammsammlung in Form von Gefrierkulturen und Lyophilisaten archiviert. Nach den Ergebnissen dieser Fall-Kontroll-Studie kann nicht auf ein ausschließliches Vorkommen von MAP bei MC-Patienten geschlossen werden, und die Gewinnung überlebensfähiger MAP gestaltet sich schwierig, möglicherweise aufgrund eines Sphäroblasten-Stadiums. Die PCR-Verfahren weisen zusätzlich auf eine weite Verbreitung von MAP bei Kontrollprobanden hin. Das angewandte Triplex PCR-Verfahren in Kombination mit einer nested PCR und der kulturellen Diagnostik liefert Ergebnisse hoher Aussagekraft über das Vorkommen von MAP in humanen Darmbioptaten. Von den für die MAP-Kultivierung untersuchten Festmedien eignete sich aufgrund der kürzesten Nachweisdauer das Herrold s Egg Yolk-Schrägmedium (Becton Dickinson®) für einen Direktnachweis am besten. Zur Beurteilung von Einzelkolonien, beispielsweise als Kontaminationskontrolle, ist der Einsatz des Middlebrook 7H10-Agars empfehlenswert (Becton Dickinson®). Um den möglichen kausalen Zusammenhang von MAP und MC zu erhellen, sind weitere Untersuchungen mit einer größeren Probandenzahl und unter Einbeziehung einer genauen Erhebung von anamnestischen, klinischen, genetischen und psychosozialen Daten sowie der MAP-Exposition nötig. The zoonotic potential of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), the causative agent of Johne s disease in human chronic inflammatory bowel disease remains uncertain. The involvement in the pathogenesis of Crohn s disease (CD) is discussed since the beginning of the last century. The Paratuberculosis data for milk cattle stock show over 80 % prevalence in many countries of the Federal Republic of Germany. Aside from the conceivable transmission of the bacteria to humans by the direct animal contact and the widespread in the environment, food has been considered as possible vector. Previous studies on the occurrence of MAP in gut tissues were based only on one single molecular detection system (e. g. Polymerase-chain-reaction [PCR]). In addition, these PCR-methods lacked of an internal amplification control (IAC) for diagnostic quality assurance and the used markers show cross reactions with other mycobacteria species. Furthermore the examination of the agent s viability was not considered. For this reasons, the present investigation included the cultivation of MAP, using a previously validated decontamination protocol, and PCR-analysis. A nested PCR system as well as a recently developed real time-PCR method were used to increase the reliability of the PCR results. In total three MAP-specific genes were used. Comparative studies of culture media were done to find appropriate media for subcultures of the mycobacteria isolates In this study the three PCR markers IS900, ISMav2 and F57 were first combined with cultural detection of MAP in human biopsies. Four (33.3 %) of the CD-, two (25.0 %) of the ulcerative colitis (UC) - and nine (75.0 %) of the control patients were positive for MAP with the PCR marker (p = 0.059). MAP could be cultivated out of the colon transversum of one control person. M. avium ssp. avium has been isolated out of the biopsies of two UC-patients as well as of a control person. The cultured strains were verified by amplicon sequencing of the 16S-ribosomal RNA (ribonucleic acid) and the 16S-23S intragenic spacer region (ITS). The three markers were sequenced as well. All isolates were preserved by deep freezing with glycerol and by freeze drying (lyophilization). On the basis of the preliminary results it can not be concluded that MAP appeared exclusively in Crohn s disease patients. In addition, the PCR-systems indicate a frequent occurrence of MAP in control specimens and the recovery of viable MAP has been proven to be difficult. The used triplex real-time PCR system combined with nested PCR and cultural detection of MAP presents reliable results. Because of the shortest time to detection Herrold s Egg Yolk Medium (Becton Dickinson®) can be recommended for isolation of MAP out of different samples (e. g. biopsy, feces). The low-priced Paratuberkulosemedium (Artelt-ENCLIT®) should be used for sub-cultures. Middlebrook 7H10-agar, prepared on plate, offers potential for the examination of single colonies (e. g. control of pure cultures).