Untersuchungen zum kulturellen und molekularbiologischen Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) aus humanen Darmbioptaten
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Zusammenfassung
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose der Wiederkäuer. Bereits seit Anfang des letzten Jahrhunderts wird aufgrund der pathomorphologischen Ähnlichkeiten ein ursächlicher Zusammenhang mit Morbus Crohn (MC), einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung des Menschen, vermutet und seitdem kontrovers diskutiert. Für Milchrinderbestände werden in einzelnen Bundesländern Seroprävalenzdaten für Paratuberkulose von bis zu ca. 80 % angegeben. Abgesehen von einer Erregerübertragung durch direkten Tierkontakt und der weiten Verbreitung des Erregers in der Umwelt, werden Lebensmittel als mögliche Vehikel diskutiert. In zahlreichen Studien wurde MAP-Desoxyribonukleinsäure im Darmgewebe von MC-Patienten und Kontrollen nachgewiesen. Nur in wenigen Untersuchungen wurde parallel die kulturelle Überprüfung der Vermehrungsfähigkeit durchgeführt. Zudem mangelt es den Polymerase-chain-reaction (PCR)-Verfahren an einer diagnostischen Qualitätssicherung mit interner Amplifikationskontrolle (IAK) und die gewählten Marker weisen Kreuzreaktionen mit anderen Mykobakterienspezies auf. In den eigenen Arbeiten wurde daher die kulturelle Anzüchtung unter Einsatz eines zuvor eigens validierten Dekontaminationsverfahrens unter Verwendung von N-Acetyl-L-Cystein-NaOH mit der PCR-Analytik kombiniert. Um die Zuverlässigkeit der Nachweisverfahren zu steigern, wurde eine nested PCR und eine kürzlich entwickelte Triplex Real Time-PCR (SCHÖNENBRÜCHER et al., 2008) inklusive einer internen Amplifikationskontrolle verwendet. So wurden erstmals die drei MAP-spezifischen Marker IS900, ISMav2 und F57 bei humanen Darmbioptaten diagnostisch kombiniert. Für die spätere Subkultivierung und Archivierung der MAP-Stämme wurden in einer vergleichenden Untersuchung preiswerte, einfach zu handhabende und produktive Selektivmedien ermittelt. Es konnten insgesamt 120 Proben von 32 Probanden berücksichtigt werden. Darunter befanden sich Bioptate von 12 MC- und acht Colitis ulcerosa (CU)-Patienten sowie 12 Kontrollprobanden, die nicht an einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung leiden. Darunter erwiesen sich Anreicherungskulturen von vier (33,3 %) MC- und zwei (25,0 %) CU-Patienten sowie von neun (75,0 %) Kontrollprobanden (p = 0,059) als molekularbiologisch MAP-positiv. Die Subkultivierung und Isolierung von MAP gelang aus dem Colon transversum einer Kontrollperson. Bei zwei Colitis ulcerosa-Patienten und einer Kontrollperson konnten vermehrungsfähige Mycobacterium avium ssp. avium-Stämme isoliert werden. Alle Isolate wurden mittels Sequenzanalyse der 16S-ribosomalen RNA (ribonucleic acid) und der 16S-23S intragenic spacer region (ITS) bestätigt und für die institutseigene Mykobakterienstammsammlung in Form von Gefrierkulturen und Lyophilisaten archiviert. Nach den Ergebnissen dieser Fall-Kontroll-Studie kann nicht auf ein ausschließliches Vorkommen von MAP bei MC-Patienten geschlossen werden, und die Gewinnung überlebensfähiger MAP gestaltet sich schwierig, möglicherweise aufgrund eines Sphäroblasten-Stadiums. Die PCR-Verfahren weisen zusätzlich auf eine weite Verbreitung von MAP bei Kontrollprobanden hin. Das angewandte Triplex PCR-Verfahren in Kombination mit einer nested PCR und der kulturellen Diagnostik liefert Ergebnisse hoher Aussagekraft über das Vorkommen von MAP in humanen Darmbioptaten. Von den für die MAP-Kultivierung untersuchten Festmedien eignete sich aufgrund der kürzesten Nachweisdauer das Herrold s Egg Yolk-Schrägmedium (Becton Dickinson®) für einen Direktnachweis am besten. Zur Beurteilung von Einzelkolonien, beispielsweise als Kontaminationskontrolle, ist der Einsatz des Middlebrook 7H10-Agars empfehlenswert (Becton Dickinson®). Um den möglichen kausalen Zusammenhang von MAP und MC zu erhellen, sind weitere Untersuchungen mit einer größeren Probandenzahl und unter Einbeziehung einer genauen Erhebung von anamnestischen, klinischen, genetischen und psychosozialen Daten sowie der MAP-Exposition nötig.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008