Isolierung und Charakterisierung equiner mesenchymaler Stammzellen für einen möglichen Einsatz im Tissue Engineering
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Zusammenfassung
Osteoarthritiden und Sehnenverletzungen sind häufige Gründe für eine erhöhte Morbidität und verminderte Leistungsfähigkeit bei Pferden oder Kleintieren.Aufgrund des langen Zeitraums, die das Gewebe für die Eigenregeneration benötigt, ist eine Auswahl an Therapiemöglichkeiten mit niedrigerer Regenerationszeit und somit mit schnellerer Belastbarkeit der Strukturen unabdingbar. Zu den mittlerweile gebräuchlichen Therapieansätzen, die sich von der konservativen Therapie bis hin zu Ersatzmaterialien belaufen, wäre es eine interessante und vorteilhafte Alternative, körpereigene Zellen aufzuarbeiten und diese in Form eines Transplantates in den Defekt einzubringen. Zu den möglichen körpereigenen Zellen gehören mesenchymale Stammzellen (MSC) aus dem Knochenmark. Das Ziel dieser Studie war, die aus dem Pferd gewonnenen und isolierten equinen Mesenchymalen Stammzellen (eMSC) näher zu charakterisieren. Um die Potenz der MSC´s für einen therapeutischen Einsatz zu untersuchen, wurden morphologische Untersuchungen mit diesen isolierten Stammzellen ex vivo durchgeführt und anschließend beurteilt.Nach Trennung der Knochenmarkflüssigkeit in ihre Bestandteile, Zellen, Blut und Restbestandteile, konnten die Zellen in einer Zellkultur aufgereinigt und expandiert werden. Im Zuge der Expansion wurden verschiedene Seren und Medien, zu Anreicherung, im Hinblick auf Proliferation getestet. Zur Beurteilung des Proliferationsverhaltens wurde ein Colony Forming Unit Assay (CFU-Assay) durchgeführt. Anhand diesem sollte gezeigt werden, wie sich das Koloniewachstum in Abhängigkeit der Zellzahl entwickelt. Um das Proliferationspotential, sowohl im Moment der Zellteilung, als auch in einem Zeitraum von 24 Stunden darzustellen, wurden die Zellen mit Ki 67 zum Zeitpunkt der Fixierung und mit BrDU über 24 Stunden konfrontiert.Nach erfolgreicher Isolation und Expansion, wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Diesen Vorgang überstanden die Zellen ohne Alterationen aufzuweisen. Selbst nach einer Kryokonservierung von 1,5 Jahren stellten sich die Zellen unverändert dar. Zur Überprüfung der Vitalität der Zellen wurden die eMSC bei unterschiedlichen Bedingungen, zum einen auf Eis und zum anderen bei 4° C, gelagert. Bei diesem Versuchsaufbau sollte geklärt werden, ob es eine Möglichkeit ist, die Zellen gekühlt zur Tierarztpraxis/-klinik zu senden. Dabei stellte sich heraus, daß eine Lagerung der Zellen unter beiden Bedingungen für zwei Tage mit nur geringem Zellverlust möglich ist. Da bekannt ist, daß im Knochenmark eine niedrige Sauerstoffspannung herrscht, wurden die Kulturbedingungen dahingehend variiert, daß der Sauerstoffgehalt von 21% auf 3% in einer Hypoxiekammer herabgesetzt wurde. Die dadurch gesteigerte Proliferationsfähigkeit der eMSC konnte sowohl mit Ki 67 als auch mit BrDU visualisiert werden. Auf den Stammzellmarker THY 1 / CD 90, der in anderen morpholgischen Studien routinemäßig eingesetzt wird, reagierten die Zellen positiv. Ein weiterer Stammzellmarker, Oct 4, konnte mittels RT-PCR nachgewiesen werden.Im Rahmen einer immunhistochemischen Charakterisierung konnte der Nachweis erbracht werden, daß die Zellen in ihrer Extrazellularmatrix (EZM) Fibronektin, Perlecan, Aggrecan und Kollagen IV exprimieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß die Interaktion mit der Extrazellularmatrix über das transmembranäre Protein ß1 Integrin erfolgt.Weitere Untersuchungen hinsichtlich der Pluripotenz der eMSC zeigten die Differenzierbarkeit der Zellen in die verschiedenen Richtungen wie Fett, Knorpel und Knochen, sowohl vor wie nach der Kryokonservierung. Untersuchungen zum Migrationsverhalten zeigten, daß eine deutliche Zellmotilität vorhanden war. Dies wurde mit Hilfe einer Phalloidin-Färbung visualisiert. Die Migration der Zellen konnte durch Zugabe von Interleukin 6 positiv beeinflußt werden. Die Transduktion der Zellen, mit einem adenoviralen Vektor, mit der Sequenz für das grün fluoreszierende Protein (GFP), zur Markierung der Zellen, konnte ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Diese Markierung soll bei einer späteren Detektion der Zellen im Zielgewebe helfen. Im Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz im tissue engineering ist die Kultivierung auf verschiedenen Trägermaterialien untersucht worden. Auf allen getesteten Trägermaterialien (Kollagen-Gel, Microcarrier und Fibrinkügelchen) war eine Kultivierung für mindestens drei Wochen möglich, ohne daß die Vitalität der Zelle abnimmt. Desweiteren wurden die Zellen in einer Rotationskultur auf Microcarriern kultiviert, einer Versuchsanordnung, die die Schwerelosigkeit imitiert und eine gleichmäßige Versorgung der Zellen garantiert. Der therapeutischer Einsatz von entnommenen, isolierten und expandierten Zellen wurde bereits erfolgreich durchgeführt. Mit Hilfe der Zellinjektion konnte ultrasonographisch eine verbesserte Durchbauung eines Sehnendefektes nachgewiesen werden. Die Pferde, bei denen eine solche Zellinjektion stattgefunden hatte, zeigten eine deutliche Besserung, bis hin zum Verschwinden, der klinischen Symptome. Der klinische Einsatz von mit Zellen beschickten Trägermaterialen soll noch in weiterführenden Studien getestet werden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler