Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Glutamat-Dehydrogenasen aus Plasmodium falciparum

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2011

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-17051

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Die Resistenzentwicklung des bedeutendsten humanpathogenen Malariaerregers, Plasmodium falciparum, gegen vorhandene Wirkstoffe, nimmt seit den 60er Jahren stetig zu und bedingt seit den 90er Jahren nahezu 50 % der Gesamtsterblichkeitsrate innerhalb der afrikanischen Bevölkerung. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung, neue Zielmoleküle zu identifizieren und darauf basierend effizienter wirkende Antimalariamedikamente zu entwickeln. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Glutamat-Dehydrogenasen 2 und 3 aus Plasmodium falciparum detailliert auf molekularer Ebene zu charakterisieren, um letztlich ihre Eignung als sogenannte drug targets zu validieren. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag auf der biochemischen und strukturellen Charakterisierung des zweiten Glutamat-Dehydrogenase Isoenzyms aus Plasmodium falciparum. Die Klonierung unterschiedlich langer PfGDH2 Konstrukte, die heterologe Überexpression dieser in E. coli Zellen und eine anschließende Separation der Proteine aus dem Bakterienlysat erbrachte letztlich ein um 49 Aminosäuren verkürztes, katalytisch aktives Enzym. Anschließend wurde die PfGDH2 (hemm-)kinetisch charakterisiert. Weiterhin wurde über proteinkristallographische Methoden die dreidimensionale Kristallstruktur des rekombinanten PfGDH2 Proteins bestimmt. Eine Überlagerung dieser Struktur mit denen bereits charakterisierter GDHs, zeigte eine große Übereinstimmung der Sekundärstrukturmerkmale mit Glutamat-Dehydrogenasen der S_50I Familie unterschiedlicher Organismen. Die an der Koordination der Substrate beteiligten Aminosäurereste sind auch in diesem Protein stark konserviert. Eine Analyse der Monomer-Monomer-Interaktionen ergab jedoch deutliche Unterschiede im Vergleich zum bereits charakterisierten ersten GDH-Isoenzym aus Plasmodium falciparum.Untersuchungen zur Lokalisation aller drei GDH-Proteine des Parasiten über Fusionsproteine mit dem green fluorescent protein (GFP) wurden durchgeführt, wodurch Hinweise darauf, in welcher Art und Weise alle bekannten Glutamat-Dehydrogenasen des Parasiten miteinander in Verbindung stehen, erhalten wurden. In silico Untersuchungen, wie das virtuelle Docking zur strukturbasierten Wirkstoffsuche, an den zwei charakterisierten plasmodialen Enzymen sowie dem humanen Vergleichsenzym, validierten die experimentell bestimmten Ergebnisse. Auf Grund der enormen Größe des dritten PfGDH Isoenzyms waren keine experimentellen Untersuchungen, sondern lediglich prädiktive Analysen zur Funktion dieses Proteins möglich. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um eine NAD+-abhängige Glutamat-Dehydrogenase der L_180 Familie, die Hexamere ausbildet, um katalytisch aktiv zu sein. Durch die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse konnten neue Einblicke in Struktur und Funktion der PfGDH2 gewonnen sowie ein mögliches Zusammenspiel aller drei GDH-Isoenzyme des Malariaparasiten aufgezeigt werden.

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