Mit einer Prävalenz von 1% ist Zöliakie (Glutenunverträglichkeit) eine der häufigsten Autoimmunerkrankungen des Gastrointestinaltrakts. Durch Aufnahme von Gluten über die Nahrung leiden genetisch prädisponierte Personen an einer Entzündungsreaktion im Dünndarm. Die Arbeitsgruppe um Zimmer et al. vermutet, dass toxische Gliadinpeptide während des intestinalen Transportwegs in den EE verbleiben und nicht in die LE transportiert werden, wodurch die Entwicklung einer oralen Immuntoleranz ausbleibt. Es ist bekannt, dass durch Konjugation an CTB der Transport in die LE mittels GM1-Rezeptor-vermittelter Endocytose erfolgt.Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Synthese farbstoffmarkierter Gliadinpeptide und der Untersuchung ihres intrazellulären Transportwegs und ist ein Kooperationsprojekt mit der Arbeitsgruppe von Prof. Zimmer aus der Abteilung für Pädiatrie und Neonatologie am Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen. Die Syntheseroute beginnt mit der Darstellung von immunodominanten und toxischen Gliadinpeptiden mittels linearer SPPS gemäß der Fmoc-Strategie und ihrer Markierung mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung konnte die Aufnahme der Gliadinpeptide in Caco-2-Zellen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie anhand eines Live Imagings verfolgt werden. Dass die Gliadinpeptid-Aufnahme tatsächlich über Endocytose erfolgt, konnte durch die Temperaturabhängigkeit der Peptidaufnahme gezeigt werden. In einem weiteren Experiment wurde mit Hilfe eines Transwellsystems untersucht, ob und wie das intestinale Epithel eine Rolle bei der Prozessierung von Gliadinpeptiden spielt. Es konnte gezeigt werden, dass beide fluoreszenzmarkierten Peptide p31-43 und p56-68 befähigt waren in Abhängigkeit von Konzentration, Temperatur und Inkubationsdauer eine intakte Monoschicht aus Caco-2-Zellen zu passieren, wobei bei p31-43 die Aufnahme mittels Endocytose bevorzugt war. Durch MALDI-TOF-Analysen nachgewiesene strukturelle Veränderungen der Peptide deuten auf eine Degradation durch Peptidasen auf der Oberfläche von Caco-2-Zellen hin. Bei der Darstellung eines CTB-Gliadinpeptid-Konjugats ist der Einbau eines selektiv spaltbaren Linkers notwendig, um das native Peptid nach dem Transport in die LE wieder freizusetzen, so dass es den Zellen des Immunsystems präsentiert werden kann. CatD befindet sich in höherer Konzentration in den LE und spaltet selektiv die Bindung zwischen zwei hydrophoben Aminosäuren innerhalb einer Polypeptidkette. Acht verschiedene Peptide wurden einem Inkubationsexperiment mit voraktiviertem CatD bei pH = 3.5 für 8 h unterzogen. Dabei wurden die meisten Substrate an den bevorzugten Stellen gespalten. Auch das toxische Gliadinpeptid p31-43, dessen Sequenz mit dem peptidischen, CatD-labilen Linker Ac-AAALA verlängert wurde, lieferte das erwartete Spaltfragment, wenn auch in geringer Konzentration. Interessant war dabei der Nachweis von weiteren Fragmenten, die Spaltprodukten des nativen Gliadinpeptids entsprachen. Offenbar ist die Degradation von Gliadinpeptiden, welche laut Literatur aufgrund des hohen Prolinanteils nicht bzw. nicht vollständig durch gastrointestinale Enzyme hydrolisiert werden, durchaus möglich, sofern sie in die LE gelangen.Dass prinzipiell Moleküle mit einer Maleimidfunktionalität für die Konjugation mit CTB geeignet sind, konnte erfolgreich mit dem bifunktionalen Linker MHS gezeigt werden. Der Einbau einer zusätzlichen Lysin-Einheit wiederum ermöglichte die Markierung mit dem PromoFluor-Farbstoff über die freie NH2-Gruppe in der Lysin-Seitenkette. Das so modifizierte, toxische Gliadinpeptid konnte in vier Schritten mit einer Gesamtausbeute von 23% dargestellt werden. Der anschließende Versuch zur Konjugation mit CTB gelang jedoch nicht, so dass eine Optimierung der Konjugationsreaktion Ziel zukünftiger Arbeiten darstellen sollte. Bei dem Verfahren der indirekten Immunofluoreszenz-Mikroskopie wurde der Zellkern von Caco-2-Zellen, sowie Zellorganelle des endosomalen Kompartimentes mit Hilfe einer Doppelmarkierungstechnik fluoreszenzmarkiert, um Aussagen über die Lokalisation von Gliadinpeptiden in EE oder LE zu treffen. Als Ergebnis ist hervorzuheben, dass es sich bei dem immunohistochemischen Verfahren zwingend um eine Rezeptor-vermittelte Antigenaufnahme handeln sollte. Ansonsten wird durch Fixierung und anschließende Permeabilisierung der Zellen, wobei bei letzterem Schritt Löcher in der Zellmembran erzeugt werden, offenbar das fluoreszenzmarkierte Gliadinpeptid aus den Zellen heraus gespült. Somit lag häufig keine ausreichende Menge des Gliadinpeptids vor, um eine evtl. vorliegende Co-Lokalisation anzuzeigen. Nach der erfolgreichen Darstellung eines CTB-Gliadinpeptid-Konjugats hingegen, könnte - aufgrund einer GM1-Rezeptor-vermittelten Endocytose des Antigens - problemlos eine Aussage über die Lokalisation des toxischen Peptids p31-43 getroffen werden.
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