Durch [Arg8]Vasotocin induzierte Translokation des Wasserkanals Aquaporin-2 im tubulären System der Hühnerniere
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Zusammenfassung
Das in magnozellulären Kerngebieten des Hypothalamus gebildete und in der Neurohypo-physe gespeicherte antidiuretische Hormon (ADH) bewirkt bei Säugetieren sowie Vögeln eine ausgeprägte renale Antidiurese. Dabei ist bei Säugern sowohl der rezeptive Mechanis-mus in den Hauptzellen der Sammelrohre (G-Protein gekoppelter, 7-transmembranaler V2-Rezeptor), die nachfolgende intrazelluläre Signaltransduktion (cAMP Bildung, Aktivie-rung der Proteinkinase A) sowie die finale Phosphorylierung vesikulär gespeicherter Was-serkanäle (= Aquaporin-2 = AQP-2) und deren Translokation in die luminale Zellmembran eingehend untersucht. Bei Vögeln hingegen konnten zwar die Hauptzellen der Sammel-rohre ebenfalls als wahrscheinlichste Zielstruktur für ADH identifiziert werden. Die mole-kulare Entität des Rezeptors sowie die nachgeschaltete Signaltransduktion hingegen blei-ben bis dato ungeklärt. Hinsichtlich der Bedeutung eines vogelspezifischen AQP-2 liegen erste Daten für die Wachtel, eingeschränkt auch für das Huhn vor.Primäres Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war daher der zelluläre Expressionsnach-weis für den Wasserkanal AQP-2 sowie dessen ADH-induzierte Translokation in die api-kale (bzw. auch laterale) Plasmamembran von Epithelzellen bestimmter Tubulussegmente der Hühnerniere mit Bezug zur Körperflüssigkeitshomöostase. Serielle Gewebsschnitte von in Paraffin eingebetteten Hühnernieren nach transkardialer Perfusionsfixation ermög-lichten zunächst aufgrund einer Hämatoxylin-Eosin Färbung die eindeutige Identifizierung der für die Vogelniere charakteristischen säugerähnlichen sowie reptilienähnlichen Glomerula sowie Epithelien aller tubulären Segmente, wie des proximalen Tubulus, der Henleschen Schleife, des distalen Tubulus sowie corticaler und medullärer Sammelrohre. Für den immunhistochemischen Nachweis des AQP-2 in der Hühnerniere kam ein gegen rattenspezifisches AQP-2 gerichtetes, polyclonales Antiserum in Form affinitätsgereinig-ter IgGs zum Einsatz. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte eine AQP-2 Expression selektiv in der Mehrzahl der Hauptzellen aus den Bereichen des Cortex renalis, corticaler sowie medullärer Sammelrohre, nicht jedoch anderen Zellen bzw. tubulären Komponenten der Hühnerniere aufgezeigt werden. Die Spezifität der Markierung konnte durch Kontroll-versuche (z.B. Absättigen der IgGs mit dem entsprechenden Antigen) untermauert werden. Interkalierende Schaltzellen der Sammelrohre aller drei Nierenbereiche waren durch das Fehlen des AQP-2 Wasserkanals, dafür jedoch ausgeprägte Expression der Carboanhydra-se II charakterisiert, ganz im Sinne ihrer Beteiligung an der Regulation des aviären Säure-Basen Haushaltes.Zur Untersuchung [1] der Translokation des Wasserkanals AQP-2 in die apikale und/oder laterale Plasmamembran der Hauptzellen, [2] einer möglichen Beteiligung von cAMP als second messenger für das vogelspezifische, antidiuretische Hormon [Arg8]Vasotocin = AVT, sowie [3] der Verteilung und Quantifizierung des Rezeptors für AVT in der Hüh-nerniere wurden für jeden dieser drei experimentellen Versuchsansätze drei Gruppen juve-niler Hühner herangezogen. Neben einer euhydrierten Kontrollgruppe (EUH) wurde einer zweiten Tiergruppe zur endogenen Stimulation des AVT-Systems für 40 Std. das Trink-wasser entzogen (DEH); einer dritten Versuchstiergruppe wurde akut für 30 min AVT (5 ng/min/kg KG) systemisch infundiert (AVT). Während die DEH-Hühner gegenüber der EUH-Kontrollgruppe bei extrazellulärer Hypovolämie und Hypernaträmie eine um den Faktor 3 stimulierte AVT Plasmakonzentration aufwiesen, war diese in der AVT-Gruppe bei unveränderten Werten des Extrazellularraumes um das 7-fache erhöht.Die homogene AQP-2 Expression vorrangig im Bereich des supranukleären bis subapika-len Zytosolbereichs der sammelrohrspezifischen Hauptzellen spiegelte die Situation des in Speichervesikeln vorliegenden, ruhenden AQP-2 Wasserkanals bei Tieren der EUH-Gruppe wieder und stellte somit die unstimulierte Ausgangssituation des AQP-2 Translo-kationsprozesses dar. Der Entzug des Trinkwassers (DEH-Gruppe) resultierte in einer sig-nifikanten Zunahme der vesikelassoziierten AQP-2 Expression im gesamten Zytosol der Hauptzellen vor allem im Bereich des Cortex renalis und corticaler Markkegel, weniger der medullären Sammelrohre. Darüber hinaus kam es zu einer Translokation des Wasser-kanals vorrangig in die luminale, in geringem Maße auch die laterale Zellmembran der Epithelzellen. Die systemische AVT-Applikation hingegen resultierte in einer ausgepräg-ten Translokation von AQP-2 primär in die laterale sowie teilweise auch in die luminale Zellmembran. Die Beteiligung intrazellulärer Komponenten des Zytoskeletts sowie von SNARE-Proteinen, sowie die mögliche Funktion einer eher lateralen anstatt rein apikalen AQP-2 Translokation bei akut erhöhten AVT-Plasmakonzentrationen werden diskutiert. Ebenfalls immunhistologische Untersuchungen zu einer möglichen Funktion von cAMP in Rahmen des AVT-induzierten AQP-2 Transfers, durch den Einsatz eines cAMP spezifi-schen Antikörpers, haben keine eindeutigen, eher negative Ergebnisse erbracht. Dieses Ergebnis lässt sich durch zahlreiche Befunde in der Fachliteratur stützen.Die Verwendung des Radioliganden [3H]Vasopressin ermöglichte es, in einer angereicher-ten Plasmamembranfraktion der Hühnerniere mittels Sättigungskinetiken die Affinität (KD) sowie Dichte (Bmax) eines AVT-rezeptiven Systems zu bestimmen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die endogene Stimulation des AVT-ergen Systems (DEH), vor allem aber die exogene Applikation des Nonapeptides (AVT) zu einer Down-Regulation des putativen Rezeptors bei unveränderter Bindungsaffinität führte. Kompetitive Verdrängungsstudien mit AVT-Strukturanaloga sowie Agonisten für bestimmte Subtypen des säugerspezifischen ADH-Rezeptors ergaben eindeutig die höchste Bindungsaffinität für AVT, bei marginaler Affinität für V2-Rezeptor spezifische Analoga. Es konnte nachgewiesen werden, dass der renal exprimierte AVT-Rezeptor des Huhnes unterschiedliche Charakteristika im Ver-gleich zu den V1a-, V1b- oder V2-Rezeptorsubtypen des Säugers aufweist. Die abschließen-de rezeptorautoradiographische Analyse konnte die funktionelle Expression des mit dem Radioliganden markierten Rezeptors im Bereich der reptilienähnlichen Glomerula sowie des Sammelrohrbereichs nachweisen. Eine Aktivierung des vogelspezifischen ADH-Systems führte somit einerseits zu einer moderaten Down-Regulation des entsprechenden, zur Situation beim Säuger jedoch unter-schiedlichen Rezeptorsystems in der Niere des Huhnes; die Beteiligung von cAMP als klassischem second messenger des ADH bei Säugern konnte in den durchgeführten Stu-dien an der Hühnerniere nicht eindeutig geklärt werden. Interessanterweise bewirkte die durch extrazelluläre Dehydratation erhöhte Plasmakonzentration an AVT in erster Linie eine Translokation des Wasserkanals AQP-2 aus seiner vesikelassoziierten, zytosolischen Position primär in die luminale Plasmamembran, wohingegen systemisch verabreichtes AVT zu einer AQP-2 Translokation vornehmlich in die laterale Plasmamembran führte.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler