Untersuchungen zum Einfluß der Faktor-VR506Q-Konzentration auf die APC-Sensitivität und Nachweis einer Faktor-V-unabhängigen den Gerinnungsfaktor X aktivierenden Protease in kultivierten hepatischen Zellen

Abstract

Die APC-Resistenz ist die bis dahin häufigste Ursache von venösen Thrombosen. Der Grund der Erkrankung in der Mehrheit des untersuchten Patientengutes liegt in einer verminderten antikoagulatorischen Antwort von APC, bedingt durch eine Punktmutation im FV-Gen. Aufgrund des Austausches der Aminosäure Arg⁵⁰⁶ durch Glu wird eine wichtige Spaltstelle für APC zerstört und FV behält lange seine prokoagulatorische Funktion, weil FVa nur verlangsamt abgebaut werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der absoluten und relativen FV^R506Q-Konzentration auf die APC-Sensitivität untersucht. Die relative FV-Konzentration ist dabei definiert als Anteil von FV^R506Q an der Gesamt-FV-Konzentration. Durch Verringerung der FV-Gesamtkonzentration erreicht man zwar keine Normalisierung der APC-Sensitivitäts-Ratio, dennoch gelingt es, die APC/aPTT in sec, bei einer FV-Konzentration im Bereich zwischen 10 und 20 %, soweit zu verlängern, daß der Wert dem einer Normal-Plasmaprobe mit 100 % FV-Gesamtkonzentration entspricht. Wird selektiv die FV^R506Q-Konzentration verändert, so ist ein FV^wt-Gehalt von mindestens 60 % gefordert, um eine APC-SR von über 2 zu erhalten sowie eine APC/aPTT, die sich im Vergleich zur aPTT mindestens verdoppelt hat. Diese Beobachtung geht konform mit der Tatsache, daß gerade heterozygote APC-Resistenz-Träger in Abwesenheit anderer Risikofaktoren ein nur geringes Thromboserisiko zeigen. Wenn parallel FV-Konzentration und FV^wt-Gehalt verändert werden, muß man eine FV-Konzentration von mindestens 60 % und einen FV^wt-Gehalt von mindestens 80 % für eine Normalisierung fordern. Mit Hilfe eines amidolytischen Testverfahrens kann selektiv FVa-Aktivität gemessen werden. Dieses Testverfahren wurde angewendet, um die FV-Syntheseleistung sowie den Regulationsmechanismus verschiedener Leberzellinien humanen Ursprungs, zu untersuchen. Zur Anwendung kamen HepG₂-Zellen, die laut Literaturrecherchen sicher FV synthestisieren. Im Zellüberstand konnte weder im amidolytischen Ansatz noch im ELISA FV nachgewiesen werden. Die Stabilität von FV im Zellüberstand wurde untersucht und konnte gezeigt werden. Nach Lysieren der Zellen wurde im kinetischen Test Aktivität gemessen. Der parallel dazu bearbeitete ELISA konnte den FV-Nachweis nicht bestätigen. Die Aktivität läßt sich durch Stimulierung mit verschiedenen Zytokinen steigern. Im amidolytischen Testansatz läßt sich die FV-Aktivität von humanem Plasma mit Hilfe eines polyklonalen anti-FV-Antikörpers vollständig blockieren, die Aktivität der HepG₂-Lysate wird im Vergleich dazu noch gesteigert. Eine FV-Aktivitätsmessung ist nur in der Gegenwart von PL möglich. Im Vergleich dazu reagieren die Zelllysate auch ohne PL. Diese gemessene Aktivität ist den Untersuchungen zufolge eine HepG₂-spezifische Aktivität. In drei weiteren untersuchten Leberzellinien humanem Ursprungs konnte nach gleicher Behandlung und Aufarbeitung kein vergleichbares Ergebnis erzielt werden.