Ein revers-genetisches System für nicht kultivierbare feline Coronaviren als Grundlage für das Studium der felinen infektiösen Peritonitis
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Zusammenfassung
Die feline infektiöse Peritonitis (FIP) zählt zu den bedeutendsten infektiösen Todesursachen bei Katzen und wird durch den letalen Biotyp (FIPV) von felinen Coronaviren (FCoVs) verursacht. Diese FIPVs entstehen aus dem klinisch inapparenten enteralen Biotyp (FECV) durch bisher unbekannte Veränderungen im Genom. Die Erforschung der Pathogenese der FIP wird dadurch erschwert, dass FCoV-Feldviren nicht in vitro kultiviert werden können. Die zur Verfügung stehenden zellkulturadaptierten FCoV-Laborstämme sind zur Aufklärung der molekularen Pathogenese der FIP nicht geeignet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein revers-genetisches System für ein FECV etabliert, welches erstmals die Erzeugung rekombinanter FECV-Feldviren ausgehend von einem cDNA-Klon ermöglichte. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erzielt: 1) Als Grundlage für die Etablierung eines revers-genetischen Systems wurde die gesamte Sequenz eines FECV-Feldvirus bestimmt. Der in dieser Arbeit verwendete Stamm wies den für feline Coronaviren typischen Genomaufbau auf. 2) Um zu zeigen, dass die bestimmte FECV-Sequenz die Replikation in infizierten Zellen ermöglicht, wurde recFECV-S79 hergestellt. Hierzu wurde das Genom des FECV-Feldvirus als cDNA in das Genom des Vacciniavirus, welches als Vektor fungiert, integriert, wobei die Sequenz des S-Gens von einem zellkulturadaptierten FCoV stammte. Ausgehend von diesem infektiösen Klon (vrecFECV-S79) konnten erfolgreich rekombinante FECVs mit heterologem Spikeprotein (recFECV-S79) hergestellt werden. 3) Anschließend wurde ein infektiöser Klon mit dem authentischen S-Gen (vrecFECV) generiert. Die erfolgreiche Herstellung von recFECV wurde mit verschiedenen Verfahren gezeigt. Zunächst wurden Coronavirus-typische Partikel im Elektronenmikroskop detektiert. Mithilfe eines M-Protein-spezifischen monoklonalen Antikörpers konnten diese Partikel in einem Western Blot als FCoVs identifiziert werden. Ein Capsid Protection Assay mit anschließender RT-PCR bzw. qRT-PCR ermöglichte den Nachweis genomischer FCoV-RNA in den gereinigten recFECV-Partikeln. 4) Weiterhin wurde durch Infektion von SPF-Katzen untersucht, ob recFECV in der Lage war, im natürlichen Wirt eine produktive Infektion zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass infizierte Katzen recFECV über mehr als acht Wochen ausschieden und serokonvertierten. Nach Beendigung des Experiments wurde die Verbreitung von recFECV in unterschiedlichen Organen durch RT-PCR und Immunhistochemie untersucht. Aus den im Tierversuch gewonnenen Daten geht hervor, dass recFECV im natürlichen Wirt eine symptomlose persistente Infektion ähnlich wie bei einer natürlichen FECV-Infektion hervorgerufen hat. Somit stellt das in dieser Arbeit etablierte revers-genetische System für ein FECV-Feldisolat ein ausgezeichnetes Werkzeug zur gezielten Erforschung der molekularen Pathogenese der FIP dar.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler Verlag