Charakterisierung ionotroper purinerger Rezeptoren im Nucleus medianus praeopticus des anterioren Hypothalamus der Ratte
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Zusammenfassung
Der Hypothalamus stellt eine reziprok mit dem Limbischen System sowie zahlreichen pontinen und medullären Kerngebieten vernetzte, phylogenetisch archaische Komponente des Diencephalon dar und gilt als dem vegetativen Nervensystem übergeordnetes primäres Regelzentrum für die Homöostase wichtiger Körperfunktionen. Als Bestandteil der den anterioren Hypothalamus rostral begrenzenden Lamina terminalis spielt der Nucleus medianus praeopticus (MnPO) eine vorrangige Rolle bei der Integration afferenter Signale bezüglich der Konstanthaltung von Körperkerntemperatur und Salz- und Wasserhaushalt der extrazellulären Körperflüssigkeit. Zudem ist er integraler Bestandteil der Regulation des Schlaf-/Wachverhaltens und in geringerem Maße auch an der Steuerung der Nahrungsaufnahme beteiligt. Zahlreiche Studien deuten daraufhin, dass ionotrope (P2X) und metabotrope (P1 und P2Y) sog. purinerge Rezeptoren (= Purinozeptoren) mit ATP, ADP, UTP und/oder Adenosin als endogenen Liganden auf der neuroanatomischen Stufe des Hypothalamus eine wesentliche Rolle als Transmitter bei der schnellen Neurotransmission im Rahmen dieser autonomen, neuronalen Regelkreise spielen. Die funktionelle Expression purinerger Rezeptoren im Bereich des MnPO ist in der Literatur bislang nicht beschrieben; daher erfolgte in der vorliegenden experimentellen Arbeit eine detaillierte pharmakologische, molekularbiologische sowie immunhisto- und immuncytochemische Charakterisierung ionotroper Purinozeptoren im MnPO. (1) Hinsichtlich der Expression verschiedener Purinozeptor-Subtypen der P2X-Familie (P2X1 P2X7) im Bereich des MnPO konnten mittels QRT-PCR geringfügige ontogenetische Unterschiede zwischen neonatalen und adulten Tieren demonstriert werden. So ergab die quantitative Analyse, dass für das MnPO-Parenchym neona-taler Ratten vor allem die mRNAs für P2X2 und P2X4, gefolgt von P2X7 und P2X6, vorrangig nachweisbar waren, bei marginaler Expression der Subtypen P2X3 und P2X5. Im MnPO adulter Tiere hingegen zeigte P2X4, gefolgt von P2X7 und P2X3, die höchsten Expressionsraten. (2) Immunhistochemisch konnte in coronalen Gehirnschnitten transkardial perfusions-fixierter, adulter Ratten die Expression der Purinozeptor-Subtypen P2X1 und P2X2 in Neuronen, teilweise auch Astrocyten des MnPO, sowie P2X4 in perivasculären Mikrogliazellen detektiert werden. Der Zelltyp-spezifische Nachweis für die Expression spezifischer P2X-Purinozeptor-Subtypen wurde zudem durch die Etablierung einer MnPO-Primärkultur aus Gehirnen neonataler Ratten durch immuncytochemische Mehrfachmarkierungen ermöglicht. P2X1-Purinozeptoren wurden von zahlreichen MnPO-spezifischen Neuronen, Astrocyten sowie Oligodendrocyten, nicht jedoch Mikrogliazellen exprimiert, wohingegen der P2X2-Rezeptor-Subtyp vorrangig in Neuronen sowie vereinzelten Astrocyten nachweisbar war. Der P2X4-Purinozeptor wurde ausschließlich in Mikrogliazellen immuncytochemisch nachgewiesen.(3) In pharmakologischen Studien an Neuronen, Astrocyten und Oligodendrocyten der etablierten MnPO-Primärkultur, welche für die kontinuierliche Analyse der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]iz) mit dem Calciumchelator Fura-2 beladen wurden, wurde durch den Einsatz unterschiedlicher, oft Rezeptor-Subtyp spezifischer Agonisten und Antagonisten das Profil ionotroper purinerger Rezeptoren auf Einzelzellniveau mikrospektrofluorimetrisch charakterisiert. Mikrogliazellen mußten aufgrund marginaler zellulärer Fura-2 AM Aufnahme von der Studie ausgeschlossen werden. Als wichtigster, genereller Agonist für die Aktivierung eines Calciumstromes durch alle P2X-Purinozeptoren wurde neben ATP das 2Me-SATP-Analog in Superfusions-Stimulationsexperimenten eingesetzt.(a) Neurone der MnPO-Primärkultur zeigten bei Superfusions-Stimulation mit 2Me-SATP (10-8 - 10-6 M/L) hinsichtlich der [Ca2+]iz keine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung, welche bei Astrocyten und Oligodendrocyten eindeutig nachweisbar war. Während für Neurone und Oligodendrocyten der Agonist-induzierte Calciumstrom vollständig von extrazellulär erfolgte, muss für Astrocyten die zusätzliche Beteiligung intrazellulärer Speicher angenommen werden.(b) Die meisten Neurone der MnPO-Primärkultur demonstrierten einen raschen Anstieg der Agonist-induzierten Calciumsignale ohne Desensibilisierungs-Effekte, sowie den Nachweis einer Erhöhung der [Ca2+]iz ohne Dekrement bei repetitiver, äquimolarer 2Me-SATP Stimulation mit selbst kurzen Zeitintervallen. In vielen Zellen der Neuroglia hingegen konnte schon während der Superfusions-Stimulation eine Densensibilisierung der entsprechenden Purinozeptoren verzeichnet werden. Darüber hinaus konnte die Responsivität gegenüber repetitiver Stimulation durch eine Verlängerung der Zeitintervalle zwischen aufeinander folgenden Agonist-Applikationen für Astrocyten und Oligodendrocyten positiv beeinflusst werden.(c) In keiner der drei Zellgruppen der MnPO-Primärkultur konnte durch P2X1/P2X3 -spezifische (alphabetame-ATP), P2X7-spezifische (Bz-ATP) sowie Adenosinrezeptor-spezifische (NECA, CCPA) Agonisten ein intrazelluläres Calciumsignal ausgelöst werden. (d) In Gegenwart zweiwertiger Zn2+-Ionen (10-5 M/L) als allosterische Modulatoren erfolgte eine Potenzierung des durch 2Me-SATP induzierten Calciumstroms bei Neuronen, sowie eine partielle Hemmung der [Ca2+]iz bei Astrocyten und eingeschränkt auch Oligodendrocyten. Alle drei Zelltypen der MnPO-Primärkultur wiesen eine Hemmung der Agonist-induzierten intrazellulären Calciumsignale durch die Purinozeptor Antagonisten mit folgender Potenz-Hierarchie auf: RB2 > TNP-ATP = PPADS. (4) Proinflammatorische Zytokine wie TNF-alpha; oder IL-6 werden in erster Linie von Mikroglioazellen und/oder Astrocyten exprimiert. Die Inkubation der MnPO-Primärkulturen mit ATP oder 2Me-SATP induzierte sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig eine Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNF-alpha und IL-6 ins Kulturmedium, wie durch Zytokin-spezifische Bioassays ermittelt. Darüber hinaus konnte die durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) stimulierte Zytokinsekretion in Gegenwart der Purinozeptor Antagonisten PPADS oder TNP-ATP partiell unterdrückt werden. (5) Für Neurone des MnPO der Ratte kann aufgrund der durch QRT-PCR sowie Immunhisto- und cytochemie ermittelten Expressionsmuster purinerger Rezeptor-Subtypen, sowie der detaillierten Charakterisierung der exprimierten Purinozeptoren die Prävalenz eines funktionellen P2X2-Rezeptors postuliert werden. Zellen der Neuroglia könnten neben dem P2X2-Rezeptor Purinozeptoren mit P2X1-ähnlicher Charakteristik sowie metabotrope purinerge Rezeptoren wie etwa P2Y1 funktionell exprimieren. An Mikrogliazellen des MnPO schließlich vermag endogenes ATP, P2X4-Purinozeptor vermittelt, proinflammatorische Zytokine wie TNF-alpha oder IL-6 freizusetzen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2009