Reverse Genetik-Systeme haben sich als nützliche Werkzeuge für die Analyse des viralen Replikationzyklus, der regulatorischen Funktion viraler Proteine und molekularer Pathogenitätsmechanismen erwiesen. Wissenschaftler haben sehr viel an reversen Genetik-Systemen für humane Influenza Viren gearbeitet, aber kaum für AIV. BDV ist immer noch eine mysteriöses Virus, zu dem es noch viele ungeklärte Fragen gibt. In dieser Studie habe ich versucht ein reverses Genetik-System für das aviäre Influenza Virus A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) und BDV zu etablieren. In dem ersten Teil meiner Arbeit wurden zur Erstellung eines reversen Genetik-System acht Pol I-Plasmide konstruiert, welche die kompletten cDNAs der acht Genomsegmente von A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) enthalten. Da bei Arbeiten mit Influneza Viren vom Subtyp H5N1 die biologische Sicherheit berücksichtigt werden muß habe ich versucht Reassortante Viren zu generieren, welche als genetischen Hintergrund jeweils sieben Gensegmente des aviären Influenza Virus A/FPV/Rostock/34 (H7N1) (FPV, Laborstamm) und eins von A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) enthalten. Hierdurch sollten meine neuen Plasmide funktionell getestet werden. Mindestens fünf Plasmide waren funktionsfähig, wie sich sowohl durch direkte (CAT-Analyse) als auch indirekte Untersuchungen (Erzeugung eines Reassortanten Virus) zeigen ließ.
Das Reassortante Virus GD1NSFPV, welches das NS-Segment von A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) und die übrigen Segmente von FPV enthält, unterscheidet sich in seinen Vermehrungseigenschaften signifikant von dem Wild Typ FPV. Zur Untersuchung worin dieser Unterschied begründet liegt, habe ich die virale Induktion der Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch beide Viren analysiert, da diese zelluläre Kaskade für die Bildung infektiöser Viren wichtig ist. Da das NS1-Protein ein wichtiger Pathogenizitätsfaktor der viralen Replikation ist habe ich auch das NS1-Protein beider Viren näher untersucht. Die Ergebnisse zeigten keine großen Unterschiede in der Aktivierung der Raf/MEK/ERK-Kaskade, was darauf hindeutet, daß hierin kein wichtiger Grund für die unterschiedlichen Wachstumseigenschaften der beiden Viren liegen kann. Mit der Hilfe von zwei Proteindomänen übt das NS1-Protein seine proviralen Funktionen aus. Teilweise durch Bindung freier RNA (dsRNA/mRNA), wodurch die Aktivierung zellulärer Verteidigungsmechanismen verhindert wird und die Translationseffizienz zellulärer mRNA zum Vorteil der Virusvermehrung reduziert wird. Die Aminosäuresequenz des NS1-Proteins von GD1NSFPV unterschiedet sich von der des FPV-NS1 speziell in der RNA-Bindungs- und in der Effekor-Domäne. Darüber hinaus resultieren dieses Unterschiede in einer Änderung der Hydrophilizität beider Proteine. Außerdem zeigte es sich, daß das reassortante GD1NSFPV Virus deutlich effizienter die zelluläre Interferonexpression unterdrückt, welche ein wichtiger initialer Schritt in der Etablierung der zellulären Immunität darstellt. Trotzdem muß der eigentliche Grund für die unterschiedlichen Vermehrungseigenschaften noch genauer bestimmt werden. Die Studien zur Pathogenität der Reassortante GD1NSFPV werden zukünftig durch Tierexperimente in China untersucht.
Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich, auf Grundlage neuer Daten (die Existenz eines 'A'-Nukleotids am äußerten 3´-Ende der genomischen Einzelstrang-RNA von BDV und einem 'U'-Nukleotid am 5´-Ende), neue Pol I-Expressionskonstrukte erstellt, die ein Reportergen (CAT) expremieren. Die Pol I-Transkripte beginnen mit einer 'Hammerhead' Ribozymsequenz (HHR), die mit einem 'A' startet, da die RNA-Polymerase I normalerweise nicht 'U' als erstes Nukleotid einbaut. Ich konnte zeigen, daß die HHR-Versionen die Transkripte in cis schneiden und so neue 5´-Enden generieren, die mit dem genomischen 'U' als erstes Nukleotid beginnen, und das die korrekten 3´-Enden der Transkripte durch ein Hepatitis Delta Virus-Ribozym (HDV) erzeugt werden, welches ebenfalls in cis schneidet. Darüber hinaus konnte ich zeigen, daß die korrekten Enden auch in vivo durch die beiden Ribozyme erzeugt werden, und das die BDV-Polymerase das antigenomische Mini-Transkript in einem BDV-abhängigen System repliziert und transkribiert. Weiterhin zeigen RPA-Ergebnisse, daß das putative Polyadenylierungssignal in der 3´-Nichtkodierenden-Region (NCR) wirklich von der viralen Polymerase genutzt wird. Zusätzlich konnte ich zeigen, daß das von dem Pol I-Expressionkonstrukt erzeugte Mini-Genom in einem plasmidbasierten reversen Genetik-System funktionell ist und dabei publizierte Daten bestätigen die zeigen, daß dieser Prozeß von einem empfindlichen Verhältnis zwischen BDV-Proteinen N und P abhängt.
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