Durch die Immunisierung von Mäusen mit renalen Bürstensaummembranen vom Schwein wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. H.Koepsell eine Reihe von monoklonalen Antikörpern generiert, die bereits ausführlich charaktierisiert wurden. Das nierenspezifischeAntigen des monoklonalen Antikörpers N4A4 wurde von den Autoren als gp400 bezeichnet. Klinisch konnte eine Eignung desmonoklonalen Antikörpers N4A4 für die nichtinvasive Urindiagnostik nachgewiesen werden, da gp400 bereits unter physiologischenBedingungen in den Urin ausgeschieden wird. Da gp400 auch in Nierenzellkarzinomen proximaltubulären Ursprungs exprimiert wird, wirdderzeit untersucht, inwiefern der Antikörper in Diagnostik und Therapie dieser Tumoren eingesetzt werden kann.
Die Identität von gp400 ist bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit hatte deshalb das Ziel, dieses Protein mit Hilfe vonproteinchemischen und immunologischen Methoden aufzureinigen, um nachfolgend eine Sequenzierung zu ermöglichen.
Initial konnte mit einer Endosomenpräparation aus dem Nierencortex von Schweinen eine ca. zehnfache Anreicherung des gp400 erzieltwerden. Diese Vesikelfraktion wurde als Ausgangsmaterial für die sich anschließenden Reinigungsschritte eingesetzt. Für dieSolubilisierung von gp400 wurde nach einem Vergleich verschiedener Detergenzien das anionische Detergenz Cholat in einerKonzentration von 2 % (w/v) ausgewählt.
Die Lektinaffinitätsreinigung mit Concanavalin A konnte keine weitere Anreicherung des gp400 erzielen. Dies lag sehr wahrscheinlich anWechselwirkungen zwischen Lektin und Detergenz. Die isoelektrische Fokussierung erbrachte zwar eine weitere Konzentrierung desgp400, kam jedoch aufgrund des hohen technischen und zeitlichen Aufwands nicht zum Einsatz. Der isoelektrische Punkt von gp400 wurdemit 6,14 bestimmt.
Zur Immunaffinitätschromatographie kam eine Protein G Säule mit kovalent gekoppelten monoklonalen Antikörpern zum Einsatz. Mit demmonoklonalen Antikörper N4A4 konnte gp400 nicht isoliert werden. Es wurde angenommen werden, daß die gleichzeitige Anwesenheitdes Detergenzes Cholat eine Antigen-Antikörperbindung unterband. Unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers L4D6 gelang dieIsolierung von gp400. Da der monoklonale Antikörper N4A4 im Western Blot mit dem von der L4D6-Säule eluierten Protein positivreagierte, konnte bewiesen werden, daß das Antigen beider Monoklonaler identisch ist. Die L4D6-Säule wurde deshalb für die Isolierungdes gp400 eingesetzt. Ca. 125 pmol des gesuchten Proteins konnten somit gewonnen werden.
Das aufgereinigte Protein sollten nach Konzentrierung mittels Ultrafiltration und enzymatischem Verdau im Gel einerAminosäurensequenzanalyse zugeführt werden. Obwohl hierbei vage eine Sequenz gelesen werden konnte, die eine 90 %ige Homologiezu einem nicht näher definierten humanen cDNA Klon besaß, muß angezweifelt werden, daß diese Sequenzdaten dem gp400 zuzuordnensind. Vermutlich ging der Großteil des aufgereinigten gp400 bereits bei der Ultrafiltration verloren.
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