Reinigung des nierenspezifischen Glykoproteins gp400 mittels Immunaffinitätschromatographie

Abstract

Durch die Immunisierung von Mäusen mit renalen Bürstensaummembranen vom Schwein wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. H.Koepsell eine Reihe von monoklonalen Antikörpern generiert, die bereits ausführlich charaktierisiert wurden. Das nierenspezifischeAntigen des monoklonalen Antikörpers N4A4 wurde von den Autoren als gp400 bezeichnet. Klinisch konnte eine Eignung desmonoklonalen Antikörpers N4A4 für die nichtinvasive Urindiagnostik nachgewiesen werden, da gp400 bereits unter physiologischenBedingungen in den Urin ausgeschieden wird. Da gp400 auch in Nierenzellkarzinomen proximaltubulären Ursprungs exprimiert wird, wirdderzeit untersucht, inwiefern der Antikörper in Diagnostik und Therapie dieser Tumoren eingesetzt werden kann. Die Identität von gp400 ist bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit hatte deshalb das Ziel, dieses Protein mit Hilfe vonproteinchemischen und immunologischen Methoden aufzureinigen, um nachfolgend eine Sequenzierung zu ermöglichen. Initial konnte mit einer Endosomenpräparation aus dem Nierencortex von Schweinen eine ca. zehnfache Anreicherung des gp400 erzieltwerden. Diese Vesikelfraktion wurde als Ausgangsmaterial für die sich anschließenden Reinigungsschritte eingesetzt. Für dieSolubilisierung von gp400 wurde nach einem Vergleich verschiedener Detergenzien das anionische Detergenz Cholat in einerKonzentration von 2 % (w/v) ausgewählt. Die Lektinaffinitätsreinigung mit Concanavalin A konnte keine weitere Anreicherung des gp400 erzielen. Dies lag sehr wahrscheinlich anWechselwirkungen zwischen Lektin und Detergenz. Die isoelektrische Fokussierung erbrachte zwar eine weitere Konzentrierung desgp400, kam jedoch aufgrund des hohen technischen und zeitlichen Aufwands nicht zum Einsatz. Der isoelektrische Punkt von gp400 wurdemit 6,14 bestimmt. Zur Immunaffinitätschromatographie kam eine Protein G Säule mit kovalent gekoppelten monoklonalen Antikörpern zum Einsatz. Mit demmonoklonalen Antikörper N4A4 konnte gp400 nicht isoliert werden. Es wurde angenommen werden, daß die gleichzeitige Anwesenheitdes Detergenzes Cholat eine Antigen-Antikörperbindung unterband. Unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers L4D6 gelang dieIsolierung von gp400. Da der monoklonale Antikörper N4A4 im Western Blot mit dem von der L4D6-Säule eluierten Protein positivreagierte, konnte bewiesen werden, daß das Antigen beider Monoklonaler identisch ist. Die L4D6-Säule wurde deshalb für die Isolierungdes gp400 eingesetzt. Ca. 125 pmol des gesuchten Proteins konnten somit gewonnen werden. Das aufgereinigte Protein sollten nach Konzentrierung mittels Ultrafiltration und enzymatischem Verdau im Gel einerAminosäurensequenzanalyse zugeführt werden. Obwohl hierbei vage eine Sequenz gelesen werden konnte, die eine 90 %ige Homologiezu einem nicht näher definierten humanen cDNA Klon besaß, muß angezweifelt werden, daß diese Sequenzdaten dem gp400 zuzuordnensind. Vermutlich ging der Großteil des aufgereinigten gp400 bereits bei der Ultrafiltration verloren. Immunizing of mice with porcine renal brush border membranes by Prof. H. Koepsell and coworkers resulted in the generation of differentmonoclonal antibodies. These antibodies already have been characterized in detail. One of these monoclonal antibodies, N4A4,recognizes a kidney specific antigen named gp400 and can be used for noninvasive urinary diagnostics as gp400 is excreted into the urineunder physiological conditions. As gp400 is expressed in renal cell carcinomas of proximal tubular origin a current study determineswhether N4A4 can be used as a diagnostic tool or a therapeutic agent for these tumors. Since the identity of gp400 is still not known, the goal of the here presented work was the purification of gp400 with biochemical andimmunological methods to allow amino acid sequencing. An approximate tenfold enrichment of gp400 could be initially achieved by vesicle preparation of porcine renal cortex. This vesicularfraction was used as starting material for further purification steps. After comparing different detergents, the anionic detergent cholic acidwas used at a concentration of 2 % (w/v) to solubilize gp400. Lectinaffinity purification with concanavalin A did not result in an enrichment of gp400, probably due to interactions between lectin anddetergent. In contrast isoelectric focusing could be used to further concentrate gp400 and to determine its isoelectric point at 6,14, but wasnot practical for large-scale purification. Therefore we tried Protein G with covalently coupled monoclonal antibodies as immuno affinity chromatography. GP400 could not bepurified using N4A4 most likely due to interference between cholic acid and the antigen-antibody-binding. However, after using L4D6isolation of gp400 was achieved. As N4A4 showed a positive reaction in western blotting of the protein eluted from the L4D6 column it wasproven that the antigen of both monoclonals is identic. A total of 125 pmol of gp400 could be recovered. After concentration by ultrafiltration and in gel digest an attempt was made to determine the amno acid sequence of gp400. Although somesequence data, which showed 90% homology to a protein encoded by a yet uncharacterized human cDNA clone could be obtained itshould be doubted whether the sequence belongs to gp400. Presumably the biggest amount of purified gp400 was already lost duringultrafiltration.