Intrazelluläre Ca2+-Transporter im Kolonepithel der Ratte : Untersuchungen von Ryanodinrezeptoren sowie SERCAs
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Zusammenfassung
Der Ryanodinrezeptor ist ein wichtiger Regulator der intrazellulären Ca2+-Homöostase. Im Kolonepithel ist dieser Ca2+-Kanal zwar funktionell bereits untersucht worden, es lagen bisher allerdings keine weiteren Daten vor. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf molekularbiologischer Ebene mittels PCR nachgewiesen, dass im Kolonepithel der Ratte der Subtyp-1 des RyRs exprimiert wird. Über immunhistochemische Untersuchungen zeigte sich seine gleichmäßige Verteilung entlang der Kryptenachse und seine zytoplasmatische Lokalisation. Da neben dem RyR-Signalweg der IP3-Signalweg als wichtigster Modulator der intrazellulären Ca2+-Freisetzung gilt, wurden immunhistochemische Doppelfärbungen durchgeführt, die ergaben, dass diese beiden Ca2+-Kanäle nicht nennenswert kolokalisiert sind. Die Spezifität des in der Immunhistochemie eingesetzten RyR-Antikörpers wurde mit einem Western Blot bestätigt. Die CD38/ADP-Ribosyl Zyklase, die die Synthese der cADP-Ribose, einem physiologischen Agonisten des RyR, katalysiert, konnte ebenfalls in Immunfluoreszenzfärbungen im Kolonepithel der Ratte nachgewiesen werden. Dieses Enzym zeigt eine zytoplasmatische Lokalisation in den Enterozyten, mit gleichmäßiger Verteilung entlang der Kryptenachse. Neben der intrazellulären Ca2+-Speicherentleerung in diesen Zellen wurde auch der Mechanismus der Wiederbefüllung untersucht. Mittels PCR wurde die Expression der SERCA Subtypen-2b oder -3 im Kolonepithel nachgewiesen. Um eine Differenzierung zwischen diesen beiden Isoformen vornehmen zu können, wurde wiederum die Immunfluoreszenz herangezogen. Sowohl SERCA-2b als auch SERCA-3 haben in diesem Gewebe zytoplasmatische und nukleäre Lokalisationen und zeigen einen leichten Gradienten von der Oberfläche der Krypten bis hin zu deren Fundus, wo sie weniger stark exprimiert werden. Monochloramin, ein Stoff, der die Öffnungswahrscheinlichkeit des RyRs erhöht, zeigte in Fura-2-Experimenten eine intrazelluläre Ca2+-Speicherentleerung, die sich durch Ruthenium Rot blockieren ließ. Arachidonsäure konnte hingegen, unter gleichen Versuchsbedingungen, keine Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern auslösen. Um die beiden wichtigsten intrazellulären Ca2+-Signalwege über RyRs und IP3Rs in direktem funktionellen Zusammenhang zu untersuchen, wurden Mag-Fura-2-Experimente durchgeführt. Sie ergaben, dass RyRs aus anderen Ca2+-Speichern Kalzium freisetzen als die IP3Rs, wobei über IP3Rs mehr Kalzium freigesetzt wurde als über den RyR-1. Im Kolonepithel der Ratte wird demnach neben dem IP3-Rezeptor Subtyp-2 und -3 auch der Ryanodinrezeptor Subtyp-1 exprimiert, der ebenfalls eine wichtige Rolle bei der intrazellulären Ca2+-Freisetzung in nicht-erregbaren Geweben spielt.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2007