Interaktion von Nop5 mit dem Exosom und natürliche Substrate des Exosoms von Sulfolobus solfataricus

Abstract

Die Prozessierung und Degradation von RNA sind essentielle Prozesse in den Zellen aller Domänen des Lebens. Während in Bakterien und Eukaryoten diese Prozesse bereits sehr gut untersucht sind, sind in Archaea vergleichsweise noch viele Fragen ungeklärt.Das Exosom von Sulfolobus solfataricus wurde 2003 entdeckt und ist ein RNA degradierender und polyadenylierender Multiproteinkomplex, bestehend aus einer hexameren Grundstruktur (Rrp41 und Rrp42) mit darauf aufgelagerter trimerer Kappe (Csl4 und Rrp4). DnaG, annotiert als bakterielle Primase, ist eine rein Archaea-spezifische Untereinheit und interagiert über Csl4 mit dem Exosom. Als zusätzlicher, potentieller Interaktionspartner konnte Nop5 zusammen mit dem Exosom über in vivo Coimmunopräzipitation identifiert werden. Nop5 ist als Scaffold Protein im Methylierungskomplex in Archaea bekannt. Ein Fokus dieser Arbeit lag darin, die Interaktion von Nop5 mit dem Exosom zu verifizieren und die Funktion von Nop5 im Zusammenhang mit dem Exosom, aufzuklären. In dieser Arbeit konnte Nop5, mittels in vitro Co-Immunopräzipitation und Biacore, als Interaktionspartner des Rrp4-Exosoms bestätigt werden. Durch Bacterial two Hybrid System Assays war es zudem möglich die CTD sowie die CC-Domäne von Nop5 als wahrscheinlichste interagierende Domänen mit Rrp4 zu identifizieren. Des Weiteren konnte über Polyadenylierungs- und Degradationsassays, unter Verwendung von poly(A)- und nuoH RNA als Substrat, gezeigt werden, dass Nop5 in der Lage ist, die Polyadenylierung, jedoch nicht die Degradation, des Rrp4-Exosoms positiv zu beeinflussen.Während die Grundstruktur des aus 9-Untereinheiten aufgebauten Exosoms, aufgeklärt ist, ist die räumliche Anordnung von DanG über Csl4 mit dem Exosom unklar. Ein weiteres Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, die Struktur des DnaG-Csl4-Exosom mittels SPEM-Analyse (single particle electron microscopy) zu untersuchen. Dafür notwendig war zunächst die Etablierung einer Methode über welche das DnaG-Csl4-Exosom in vivo, in E. coli, überexprimiert und anschließend, mittels Heparinsäule und Größenausschlusschromatographie, aufgereinigt werden konnte. Als Kontrolle wurde parallel dazu das Csl4-Exosom, über oben genannte, Methodik aufgereinigt. Während das Csl4-Exosom im Elektronenmikroskop klare Einzelkomplexe zeigte, konnten für das DnaG-Csl4- Exosom nur Aggregate nachgewiesen werden.Auch die Substratspezifität des Exosoms sollte in dieser Arbeit tiefer untersucht werden. Zu Projektbeginn war bekannt, dass die Untereinheiten Rrp4 und DnaG des Exosoms eine Präferenz für Adenin-reiche Substrate aufweisen, welche Csl4 nicht besitzt. Die Organisation der Domänen und deren strukturelle Anordnung auf dem Exosom von Csl4 und Rrp4 ist jedoch sehr ähnlich zueinander. Entsprechend war es von Interesse welche Domäne von Rrp4 für die Poly(A)-Präferenz verantwortlich ist. Nachdem sich während der Bachelorarbeit von J. Grützner bereits gezeigt hatte, dass eine Substitution von einzelnen Aminosäuren zwischen Csl4 und Rrp4 keinen weiteren Aufschluss über die Positionierung der Poly(A) Präferenz geben konnte, sollte jetzt die Substitution der vollständigen S1-Domäne zwischen Rrp4 und Csl4 zunächst die Lokalisierung der Poly(A)- Präferenz in der S1-Domäne verifiziert werden. Leider war ein Transfer der Poly(A)-Präferenz von Rrp4 auf Csl4 mittels Substitution der S1-Domäne zwischen Rrp4 und Csl4 nicht möglich, da die Hybridproteine Rrp4S1Csl4 und Csl4S1Rrp4 keine stabilie Interaktion mit dem hexameren Ring zeigten.Mittels iCLIP (individual nucleotide resolution cross-linking and immunoprecipitation) konnten in dieser Arbeit erstmals natürliche Substrate des Exosoms von S. solfataricus bestimmt werden, welche bevorzugt durch das Exosom gebunden und angereichert werden. Durch diese Analyse wurde ein ungewöhnlich hoher Anteil an nicht kartierbaren cDNA reads festegestellt, welche einen erhöhten Adenin-Anteil aufweisen und sich durch die Polyadenylierungsfunktion des Exosoms von S. solfatricus begründen ließen. Eines der angereicherten Substrate, die antisense tRNASer, konnte anschließend mittels EMSA-Assays verifiziert werden. Des Weiteren wurden zirkuläre RNAs identifiziert, welche an das Exosom gebunden waren. Darunter waren, neben bereits bekannten zirkulären RNAs, wie der 16S rRNA und der 23S rRNA, auch noch bisher unbekannte zirkuläre RNAs. Zwei dieser unbekannten zirkulären RNAs (die RNA der Transposasen SSO_RS05855 und SSO_ RS06560) konnten experimentell, mittels RNase R Verdau und RT-PCR, als zirkuläre RNAs verifiziert werden.

The processing and degradation of RNA are essential processes in the cells of all domains of life. While in bacteria and eukaryotes these processes are already well studied, in Archaea comparatively many questions remain unanswered.The exosome of Sulfolobus solfataricus was discovered in 2003 and is an RNA degrading and polyadenylating multi-protein complex consisting of a hexameric ring (Rrp41 and Rrp42) with a trimeric cap (Csl4 and Rrp4). DnaG, annotated as a bacterial primase, is an archaea-specific subunit and interacts with the exosome via Csl4. As an additional, potential interaction partner, Nop5 could be identified together with the exosome via in vivo co-immunoprecipitation. Nop5 is known as a scaffold protein in the methylation complex in Archaea. One focus of this work was to verify the interaction of Nop5 with the exosome and to elucidate the function of Nop5 in the context to the exosome. In this work, Nop5 could be confirmed as an interaction partner of the Rrp4 exosome by in vitro co-immunoprecipitation and biacore studies. Bacterial two hybrid system assays also allowed the identification of the Nop5 CTP and the Nop5 CC domain as the most likely interacting domains with Rrp4. Furthermore, polyadenylation and degradation assays, using poly (A) and nuoH RNA as the substrate, have shown that Nop5 is able to positively affect the polyadenylation, but not the degradation, of the Rrp4 exosome.While the basic structure of the 9-subunit exosome has been elucidated, the spatial arrangement of DanG via Csl4 with the exosome is unclear. Another aim of the present study was to investigate the structure of the DnaG-Csl4 exosome by single particle electron microscopy (SPEM) analysis. Initially, it was necessary to establish a method by which the DnaG-Csl4 exosome could be overexpressed in vivo, in E. coli, and subsequently purified by means of heparin column and size-exclusion chromatography. As a control, the Csl4 exosome was purified in parallel using the above-mentioned methodology. While the Csl4 exosome showed clear single complexes in the electron microscope, only aggregates could be detected for the DnaG Csl4 exosome.The substrate specificity of the exosome should also be further investigated in this work. At the beginning of the project, it was known that the subunits Rrp4 and DnaG of the exosome have a preference for adenine-rich substrates that Csl4 does not possess. The organization of the domains and their structural arrangement on the exosome of Csl4 and Rrp4, however, are very similar. Accordingly, it was of interest which domain of Rrp4 is responsible for the poly (A) preference. After it had already been shown during the bachelor thesis of J. Grützner that a substitution of single amino acids between Csl4 and Rrp4 could not provide further information about the positioning of the poly (A) preference, the substitution of the complete S1 domain between Rrp4 and Csl4 should here verify the localization of the poly (A) preference in the S1 domain. Unfortunately, transfer of the poly (A) preference of Rrp4 to Csl4 was not possible by substitution of the S1 domain between Rrp4 and Csl4, as the hybrid proteins, Rrp4S1Csl4 and Csl4S1Rrp4 showed no stable interaction with the hexameric ring.By means of iCLIP (individual nucleotide resolution cross-linking and immunoprecipitation) it was possible for the first time to determine natural substrates of the S. solfataricus exosome, which are preferentially bound and "enriched" by the exosome. By this analysis, an unusually high proportion of non-mappable cDNA reads were found, which have an increased adenine content and could be justified by the polyadenylation function of the exosome of S. solfataricus. One of the enriched substrates, the antisense tRNASer, could subsequently be verified by EMSA assays. Furthermore, circular RNAs were identified which were bound to the exosome. In addition to previously known circular RNAs such as 16S rRNA and 23S rRNA, these included previously unknown circular RNAs. Two of these unknown circular RNAs (the RNA of the transposases SSO_RS05855 and SSO_RS06560) could be verified experimentally by means of RNase R digestion and RT-PCR as circular RNAs.