Studien zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NtcA in Synechococcus elongatus PCC 7942

Abstract

Die Assimilation von Stickstoffverbindungen ist in Cyanobakterien für ihr Wachstum von zentraler Bedeutung. Die Expression der Gene, die für stickstoffassimilierende Funktionen kodieren, unterliegt dem sogenannten global nitrogen control . Ein Schlüsselelement dieses Prozesses ist der Transkriptionsfaktor NtcA. Alle bisherigen untersuchten stickstoff-regulierten Gene weisen in ihrer Promoterregion eine NtcA-Bindestelle auf. Die Bindung von NtcA an die DNA ist nötig für die Transkriptionsinitiation an den entsprechenden Promotern. Neben NtcA wurde in Cyanobakterien auch das Signalprotein PII nachgewiesen, das in Proteobakterien eine zentrale Rolle der Stickstoff-Regulation spielt. In unserer Arbeitsgruppe wurde die Signalperzeption des PII Proteins detailliert analysiert, jedoch war die Beziehung zwischen PII und NtcA ungeklärt.

Durch die in vivo Analyse der Expression der NtcA-regulierten Gene (glnB und glnN) mit Hilfe von Reportergenen (luxAB) konnte die Beziehung zwischen PII und NtcA identifiziert wurden. Es wurde gezeigt, dass es unter Stickstoffmangel zu einer raschen Aktivierung der NtcA-abhängigen Transkription sowohl beim glnB- als auch beim glnN-Promoter kam. Diese rasche Aktivierung ist abwesend in PII- und NtcA-defizienten Mutanten. Daraus muss gefolgert werden, dass PII für die Aktivierung der NtcA unter Stickstoffmangelbedingungen erforderlich ist.

Durch die in vitro Analyse der direkten Interaktion zwischen PII und NtcA mit Hilfe der Biacore- und Gelshift-Experimente konnte die direkte Interaktion zwischen PII und NtcA identifiziert wurden. Diese direkte Interaktion ist nur durch ihre Effekte zu beobachten:

1) Ein positiver Effekt von PII-D, das der phosphorylierten Form des PII ähnelt, auf die NtcA-DNA-Bindung. 2) Ein negativer Effekt von PII0auf die NtcA-DNA-Bindung.

Starke Bindung zwischen NtcA und PII, wie z.B. zwischen PII und NAGK (N-Acetyl-L-Glutamat Kinase) ist nicht zu sehen.

Weitere Ergebnisse dieser Arbeit sind:

1) Es wurde ein Repressorelement in der glnN-Promoterregion entdeckt, das die Promoteraktivität repremiert. Durch die schrittweise Verkürzung der glnN-Promoter konnte die Bindestelle des Repressors identifiziert wurden. Sie lag zwischen -226 und -314 bp stromaufwärts des Start-Kodons der glnN-Gene. 2) Es wurde eine neue ATPase-Reaktion von NtcA entdeckt, die zu einem neuen unbekannten Produkt führt. Diese Reaktion wird durch PII signifikant beeinflusst. Während PII-D auf dieser Reaktion positiv wirkt, wirkt PII0 negativ.