Untersuchung des signalvermittelten Kerntransportes von DFF (DNA-Fragmentierungsfaktor) durch Importin alpha 3/ Importin beta

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2008

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10097

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In dieser Arbeit wurden die Kernlokalisationssequenzen der Untereinheiten des DFF-Komplexes, der murinen Nuklease CAD und des humanen und murinen Inhibitors DFF45/ICAD-L, anhand von fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen untersucht und klassifiziert. Bereits zu Beginn der Arbeit war bekannt, dass im C-Terminus beider DFF-Untereinheiten Kernlokalisationssignale, geprägt von basischen Aminosäureresten, zu finden sind. Um herauszufinden, ob es sich um ein- oder zweiteilige Kernlokalisationssignale handelt, wurden EGFP- und DsRedMonomer-fusionierte Deletionsmutanten, sowie Mutanten mit Austausch einzelner basischer Aminosäuren generiert und die Lokalisation in eukaryontischen Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dabei zeigte sich, dass DFF40/CAD ein nicht-klassisches NLS mit zwei benachbarten basischen Aminosäureresten beinhaltet, die für den Kerntransport von Bedeutung sind. In DFF45/ICAD-L wurde ein klassisch einteiliges Kernlokalisationssignal gefunden. Des Weiteren wird in dieser Arbeit gezeigt, dass für den effektiven Transport des DFF-Komplexes die Kernlokalisationssignale beider Untereinheiten von Bedeutung sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der heterodimere Komplex aus Importin alpha und Importin beta den Kerntransport von DFF bewerkstelligt, wobei die Isoform Importin alpha 3 als bedeutendster Rezeptor ermittelt werden konnte. Durch Untersuchung der Topologie der Bindung von DFF zeigte sich, dass DFF40 an die sekundäre und DFF45 an die primäre Bindestelle bindet, was vermuten lässt, dass ein Heterodimer aus DFF40/DFF45 von einem Importin alpha 3-Molekül gebunden wird. Die Cluster basischer Aminosäuren in DFF40 und DFF45 imitieren dabei die Konsensussequenz eines klassisch zweiteiligen Kernlokalisationssignales. Mikroskopische Untersuchungen, basierend auf unterschiedlicher Fluoreszenzfarbe der beiden Untereinheiten von DFF, unterstützen die Annahme, dass DFF in vivo als Tetramer DFF402/DFF452 in den Zellkern transportiert wird.Unter Berücksichtigung aller erhaltenen Ergebnisse konnte folgendes Kerntransportmodell aufgestellt werden: Ein Tetramer DFF402/DFF452 wird von je zwei Molekülen Importin alpha 3/Importin beta in den Kern transportiert, wobei ein Importin alpha -Molekül einen Heterodimer aus DFF40 und DFF45 über C-terminale Kernlokalisationssignale an die primäre und sekundäre NLS-Bindestelle bindet.

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