In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Transkription, Replikation und Verpackung (Passage) viraler Fremdsegmente über dieLänge der größten Virus-eigenen Segmente (2341 nt) hinaus bis auf 4000 nt ausgedehnt werden kann. Transkriptions- undReplikations-Effizienz sinken jedoch mit zunehmender Länge ab.
Mit Hilfe des RNA-Polymerase I-Transkriptionssystems konnte der Einfluss von gezielt gesetzten Mutationen in der cRNA-Promotorstrukturdetektiert werden. Für die direkte Untersuchung des cRNA-Promotors wurde die DNA-Sequenz, die in dem RNA-PolymeraseI-Transkriptionskonstrukt für das RNA-Segment kodiert, so verändert, dass nach in vivo Transfektion eine cRNA entsteht, die ihrerseits dieTranskription einer Reportergen-mRNA initiieren kann. Nach Infektion bzw. Expression der viralen Polymerase und des NP-Proteins liesssich die Aktivität des Reportergens nachweisen. Somit wurde die Fähigkeit des cRNA-Promotors zum Transkriptionsstart erstmalignachgewiesen. Zu diesem Zweck wurde das kodierende CAT-Gen in inverser Orientierung (als Minusstrang-Sequenz) eingesetzt und am5´-cRNA-Promotorende zusätzlich eine Folge von 6 Uridin-Basen eingefügt, um die Polyadenylierung der mRNA zu ermöglichen.Basierend auf der Mutationsanalyse des vRNA-Promotors ist die komplementäre cRNA-Promotorsequenz in gleicher Weise durchSubstitution und Doppelsubstitution untersucht worden. Die Mutationsanalyse des cRNA-Promotors zeigt, dass die aktivecRNA-Promotorstruktur, wie die des vRNA-Promotors, eine 'corkscrew'-Sekundärstruktur aufweist. Allerdings unterscheidet sich dieErkennungs- und Bindungs-Konformation der viralen RNA-Polymerase in der Interaktion mit einer optimierten cRNA-'corkscrew'-Struktur ineinigen Einzelheiten von der Wechselwirkung mit der vRNA-'corkscrew'-Struktur. Zur Bestimmung aller basenspezifischenErkennungselemente der viralen Polymerase bedarf es weiterer cRNA-Promotoranalysen. Die Analyse der 5´-Endsequenzen der aus dercRNA synthetisierten mRNA (c-mRNA) nach der RACE-Methode ergab, dass die 5´-Promotorsequenz durch Fremdsequenzen verlängertvorliegt, wie es für die aus der vRNA gebildete mRNA (v-mRNA) typisch ist. Auch der c-mRNA-Transkriptionsstart ist daher ein'cap-snatching'-Prozess.
Das unterschiedliche Verhalten der CAT-Expression der cRNA und vRNA bei den NP-Abhängigkeitsversuchen und die Ergebnisse derRACE-Analyse bestätigen, dass die in unserem System nach einer Infektion nachgewiesene CAT-Expression die Transkriptionsaktivitätder cRNA- bzw. der vRNA-Moleküle widerspiegelt und nicht die Replikation.
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die cRNA außer der bekannten Replikations- eine Transkriptionsaktivität aufweist, war es möglich,cRNA- und vRNA-Transkription in einem System zu kombinieren. Dies enthält in einem ambisense bicistronischen RNA-Segment zweiTranskriptionseinheiten mit zwei einander entgegengesetzt orientierten Genen. Darin kann die Transkription des einen Gens von demambisense cRNA-Promotor, die des anderen Gens von dem ambisense vRNA-Promotor aus gestartet werden. Für die Polyadenylierungist beiderseits eine U6-Sequenz benachbart zur 5´-Promotorsequenz eingeführt worden. In den primär transfizierten Zellen lässt sich dieExpression der ambisense Gene CAT und GFP nachweisen. In den passagierten Zellen lässt sich bei diesen Konstrukten die Expressiondesjenigen Gens mit deutlicher Leistung nachweisen, dessen Transkription von dem vRNA-Promotor des ambisense Segmentes ausgestartet wird. Um die Expression desjenigen Gens weiter zu stärken, dessen Transkription von dem cRNA-Promotor des ambisenseSegmentes aus gestartet wird, bedarf es weiterer Experimente. Jedoch zeigen die Ergebnisse, dass ein solches ambisense Segment vonder viralen RNA-Polymerase transkribiert und repliziert wird. Außerdem wird das virale ambisense Segment in die Tochter-Virionenverpackt. Mit diesem System kann man zwei verschiedene Gene, z.B. ein Influenza-eigenes und ein beliebiges Fremdgen, zu einemambisense Segment kovalent zusammenfügen, mit der Gewähr für einen stabilen Aufbau eines solchen rekombinanten Influenza-Virus.
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