Die Bedeutung parakrin freigesetzter Zytokine adulter kardialer Progenitorzellen für das Remodeling des insuffizienten Herzens

Abstract

Einleitung: Herz-Kreislauferkrankungen gehören zu den häufigsten Erkrankungen der Bevölkerung in den Industrienationen und Ihre Bedeutung in der Tiermedizin bezüglich Diagnose und Behandlungen wird immer wichtiger. Die Erforschung neuer Therapieoptionen hat einen hohen Stellenwert in der nationalen und internationelen Forschung. Im letzten Jahrzehnt wurden kardiale Progenitorzellen (oder auch adulte Stammzellen) entdeckt und die Forschung musste das lang vorherrschende Dogma, das Herz sei ein terminal differenziertes Organ, in Frage stellen. Die ursprüngliche Annahme, dass diese Zellen einen direkten Zellersatz bewirken ist mittlerweile widerlegt. Vielmehr konnte in vielen Studien bewiesen werden, dass sie ihre Wirkung durch autokrine, parakrine und endokrine Mechanismen vermitteln. Durch die Bildung einer Vielzahl an Mediatoren sind Progenitorzellen in der Lage, die sie umgebenden Zellen zu beeinflussen. Im Zuge der Erforschung dieser Vorläuferzellen wurde deren Kultivierung in sogenannten kardialen Progenitorzellkulturen (CPC-Kulturen) möglich gemacht. In dieser Arbeit vorangegangenen Untersuchungen konnten in den konditionierten Überständen eine Reihe von Zytokinen in besonders hohen Konzentrationen detektiert werden. Diese waren die Zytokine Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), growth differentiation factor-15 (GDF-15) und der Faktor tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1). Diese 5 Mediatoren wurden in dieser Arbeit auf Ihre Kontraktions-modulierenden Eigenschaften hin untersucht. Ergebnisse: Um dies zu untersuchen wurden Kardiomyozyten zum einen von normotensiven Wistar-Ratten und zum anderen von hypertensiven SH-Ratten gewonnen. Diese wurden über 24 Stunden mit den jeweiligen Mediatoren inkubiert und anschließend im elektrischen Feld stimuliert. Wichtigster Parameter der Messung der kontraktilen Funktion war die Differenz der diastolischen und systolischen Zelllänge in Prozent (& #916;L/L%); die fraktionelle Zellverkürzung. vier der fünf untersuchten Mediatoren zeigten einen positiven Effekt auf die kontraktilen Eigenschaften isolierter Kardiomyozyten. Lediglich GDF-15 beeinflusste in allen getesteten Konzentrationen nicht die fraktionelle Zellverkürzung. Die genannten Effekte waren besonders prominent ausgeprägt bei isolierten Kardiomyozyten normotensiver Ratten, während Kardiomyozyten hypertensiver Ratten (SHR) deutlich weniger sensibel auf die applizierten Zytokine reagierten. Die aufgestellte Hypothese, die Ursache der gesteigerten kontraktilen Funktion sei in der veränderten Zusammensetzung der Kalziumtransporter SERCA und NCX zu finden, ließ sich auf Proteinebene nur für IL-6 bestätigen. Unter den fünf untersuchten Zytokinen erwies sich IL-6 als besonders interessant. Neben den signifikanten Effekten bei der Einzelapplikation, erwiesen sich Zytokin-Kombinationen mit IL-6 stets als steigernd auf die kontraktile Funktion. Durch den Einsatz spezifischer IL-6 Antikörper konnte die besondere Stellung von IL-6 in diesem Kontext bewiesen werden. Ein alternativer Ansatz zur Reduktion der IL-6 Wirkung in konditionierten Überständen, lag im Einsatz spezifischer siRNAs gegen IL-6. Es konnte zwar eine Reduktion der IL-6 Freisetzung erzielt werden, eine komplette Reduktion war jedoch nicht möglich. Folgerichtig bewirkten diese konditionierten Überstande auch weiterhin eine Steigerung der kontraktilen Funktion. Die Supplementierung der Zytokine zu den CPC-Kulturen selbst - im Sinne einer au-tokrinen Wirkung - veränderte nicht die Kontraktions-steigernden Eigenschaften der gewonnenen konditionierten Medien. Schlussfolgerung: Vorläuferzellen beeinflussen ihre Umgebung durch die Freisetzung einer Vielzahl von Mediatoren. Um deren Wirkung zu verstehen, ist die Betrachtung einzelner Faktoren notwendig. Diese Arbeit fokussierte auf die Beeinflussung der kontraktilen Funktion isolierter Kardiomyozyten. Es konnte gezeigt werden, dass diese Funktion von einigen Zytokinen besonders stark positiv beeinflusst wird. Die Erhaltung der Funktionsfähigkeit von Kardiomyozyten ist Voraussetzung für das Überleben des Organs und damit des Organismus. Unterschiedliche Erkrankungen gehen aber mit einem Untergang von Herzmuskelgewebe einher. Das Herz ist je nach Ausmaß des Schadens in der Lage, diesen Schaden zu kompensieren. Die im Herzen ansässigen Progenitorzellen sorgen mit der Freisetzung eines Zytokin-Cocktails und dessen parakriner Wirkung dafür, dass die gesunden Kardiomyozyten die Funktion der geschädigten Zellen kompensieren und damit die Funktion des Organs in toto aufrechterhalten. Die darüber hinausgehende Bedeutung von Vorläuferzellen im Zuge des kardialen Remodelings muss weiteren Untersuchungen überlassen bleiben. Cardiovascular diseases are the most common diseases among humans in industrial countries.The collaboration between basic and clinical research has led to a dramatic increase in knowledge, which makes more effective therapies for heart disease possible. During last decade cardiac progenitor cells (or adult stem cells) were discovered, which led research to question the prevailing dogma whether the heart was a terminally differentiated organ. Currently subject of many studies is the function and mechanisms of cardiac progenitor cells. Today we know without controversy that they mediate their effects through autokrine, parakrine and endocrine mechanisms. Through the production of mediators, progenitor cells are capable to influence their environment. While researching progenitor cells their cultivation was made possible in so-called cardiac progenitorcellcultures (CPC-Culture). Further studies found out, that these CPCs secrete substances into the medium. The examination of these conditioned supernatants detected a number of cytokines in very high concentrations. These were Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), growth differentiation factor-15 (GDF-15) and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1). The present study examines these cytokines in detail and focuses on their effect on the contractile function of isolated cardiomyocytes. Cardiomyocytes of normotensive Wistar-rats and hypertensive SH-rats were extracted. The cardiomyocytes were incubated with the respective cytokine for 24 hours, followed by stimulation in an electric field. The most important parameter of contractile function is the difference between the diastolic and systolic cell length in percent (ΔL/L%); the fractional cell shortening. The dose-response-curve of all different cytokines, concentrations and combinations showed positive effects on the contractile function, except for GDF-15. This effect was particularly evident in isolated cardiomyocytes of normotensive rats, whereas isolated cardiomyocytes of hypertensive rats (SHR) reacted significantly less sensitive to the cytokines.Our assumption that the cause of the increased contractile function would be found in the altered composition of calcium transporter SERCA and NCX was confirmed on protein level only for IL-6. Among the five examined cytokines IL-6 proved to be particularly interesting, because of its well studied effects as a proinflammatory cardiac cytokine. Not only concentrations of 10 ng/ml, 100 ng/ml and 1 µg/ml IL-6 had significant effect on contractile function, cytokine combinations with IL-6 as well always increased contractile function. Using specific IL-6 antibodies proved that IL-6 as a cytokine has positive effects on the contractile function.Treatment of CPC-culture from rats with cytokines and subsequent incubation of isolated cardiomyocytes with the supernatants of these cells had no effect on contractile function. To investigate the effect of conditioned supernatants without IL-6 on isolated cardiomyocytes, an attempt was made by blocking IL-6 expression with specific siRNA. Although it was able to reduce IL-6 expression, it was not possible to turn it off completely and high IL-6 concentrations remained in the supernatant. As expected using this supernatant on isolated cardiomyocytes showed a significant increase in the contractile function - which individual measurements of IL-6 had already demonstrated.