Charakterisierung der Entwicklung der Wiederkäuerplazentome

Abstract

Die vorliegende Arbeit charakterisiert die der Plazentation der Wiederkäuer, insbesondere Rind und Schaf, zu Grunde liegenden Mechanismen unter besonderer Berücksichtigung der Migration der Trophoblastriesenzellen (TGC) und der plazentären Angiogenese. Im Plazentom des Rindes wird das zelluläre Zytoskelett und ein Schlüsselenzym der intrazellulären Phosphorylierungskaskade (mitogen-activated protein kinase, MAPK) mit immunelektronenmikroskopischen Methoden analysiert und über einen mRNA Nachweis bestätigt. Weiterhin wird im bovinen Plazentom die Expression von Integrinen und extrazellulärer Matrix (ECM) immunhistochemisch sowie von Connexinen auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Beim Schaf werden Integrine und ausgewählte Proteine der ECM während der Implantation in vivo und in vitro evaluiert sowie Osteopontin, als Produkt der uterinen Drüsen, im Verlauf der Trächtigkeit mit Immunfluoreszenz und molekularbiologischen Methoden untersucht. Connexine werden beim Schaf im Zyklus und während der Gravidität mittels Immunfluoreszenz dargestellt. Die Entwicklung des Gefäßsystems, als formgebende Determinante der feto-maternalen Interdigitation, wird während der Plazentation des Rindes rasterelektronenmikroskopisch mit Hilfe von Gefäßkorrosionspräparaten untersucht. Der Einfluss von Hypoxie als Angiogenesefaktor wird in Gefäßausgüssen der reifen Schafplazenta rasterelektronenmikroskopisch ermittelt und mittels Morphometrie an histologischen Schnitten bestätigt. Weiterhin wird mit verschiedenen Mitgliedern der Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) ein wichtiges Regulationssystem, welches in die Angiogenese sowie die Zelldifferenzierung eingreift, in der Rinderplazenta auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Aktin, alpha-Aktinin, Vinculin und die MAPK zeigen eine zellspezifische Lokalisation im Rinderplazentom, die für eine Beteiligung an der eingeschränkten Trophoblastinvasion spricht. Die konstitutive Expression von Integrinen und die spezifische Modulation von Proteinen der ECM während der Implantation des Schafes sowie die in vitro Akkumulation von mit dem Zytoskelett assoziierten Proteinen als Reaktion auf Osteopontinbindung, deuten auf eine Funktion von Osteopontin im Verlauf der Implanationskaskade sowie während der Gravidität des Schafes hin. Im Plazentom des Rindes zeichnen sich die TGC durch eine besondere Ausstattung an Integrinrezeptoren und ECM aus, die mit der von Tumorzellen vergleichbar ist, und daher möglicherweise bei der Migration der TGC eine Rolle spielt. Beim Schaf spricht die spezifische Modulation der Connexinexpression als Antwort auf eine Trächtigkeit und um die Geburt für einen invasiveren Status, als bei nicht invasiven epitheliochorialen Plazentationstypen. Dagegen zeichnen sich die TGC im Rinderplazentom durch die gleichzeitige Expression von 'epithelialen' und 'mesenchymalen' Connexinen aus, was auch beim Rind einen Status zwischen invasiver und nicht invasiver Plazentation vermuten lässt. Die Analyse des Gefäßsystems der Rinderplazenta zeigt im sterischen Zusammentreffen der fetalen Zottenbäume und maternalen Krypten die Etablierung einer effektiven feto-maternalen Austauscheinheit. Zu Beginn der Trächtigkeit treffen sich fetale und maternale Gefäße nach dem Gegenstromprinzip, wohingegen sich mit fortschreitender Entwicklung der Kapillaren, das heißt ab der Mitte der Gravidität, ein Querstrommuster etabliert. Der Vergleich des Gefäßsystems geburtsnaher Plazentome von auf Meereshöhe und im Hochgebirge gehaltenen Schafen demonstriert die Adaptation an hypobare Hypoxie über eine Vergrößerung der fetalen und maternalen Austauschfläche über Angiogenese. Die spezifische Lokalisation von FGFs nicht nur in gefäßassoziierten Zellen sondern auch in unreifen TGC im Rinderplazentom deutet auf Funktionen im Rahmen der plazentären Angiogenese sowie für die Differenzierung und Migration der TGC. Der präpartale Wechsel der Expression aus dem Epithel in das maternale Stroma des Plazentomes deutet auf eine Umstellung auf die bevorstehende Regression des Uterus nach der Geburt hin. Der schon bei der Connexinexpression beobachtete Intermediärstatus der bovinen TGC bestätigt sich auch in der parallelen Ausbildung von mesenchymalem FGF1 und FGF2 sowie epithelialem FGF7. Die Expression von FGFs und FGF Rezeptoren im Zytoplasma sowie in Kernen plazentärer Zellen des Rindes lässt autokrine und/oder intrakrine Regulationsmechanismen vermuten. Zusammengenommen unterstützen die Ergebnisse der vorgelegten Schrift die Hypothese, dass die eingeschränkte Trophoblastinvasion in der Plazenta des Rindes auch als Modell für andere invasive Prozesse gelten kann. Allerdings sind weitere Analysen, besonders die Etablierung eines in vitro Zellkultursystems für eine abschliessende Beurteilung sowie die anschliessende Anwendung dieses überschaubaren Invasionsmodells unabdingbar. The basic mechanisms of ruminant placentation are characterized with special reference to trophoblast giant cell (TGC) migration and placental angiogenesis. In bovine placentomes the actin cytoskeleton and its associated proteins as well as one key-enzyme of intracellular phosphorylation cascades (mitogen-activated protein kinase, MAPK) are evaluated by immuno transmission electron microscopy and RT-PCR. The expression of integrins and proteins of the extracellular matrix (ECM) in placentomes of the cow are examined by immunohistochemistry. Furthermore, protein and mRNA of gap junctional connexins are shown by immunohistochemistry and RT-PCR. During sheep implantation integrins and selected components of the ECM are evaluated in vivo and in vitro, and osteopontin, a uterine gland product is studied in the course of gestation by immunofluorescence and molecular biological methods. Connexins are detected by immunofluorescence in cyclic and pregnant sheep. The development of the bovine placentomal vasculature as shaping power of the feto-maternal interdigitating structures is studied by scanning electron microscopy of vascular corrosion casts throughout gestation. The angiogenic properties of hypoxia in near-term sheep placentomes are tested by scanning electron microscopy of vascular casts and morphometry of histological sections. Since fibroblast growth factors (FGFs) are involved in both, angiogenesis and differentiation of cells, various members of the FGF system are studied in placentomes of cattle on protein and mRNA level. In bovine placentomes actin, alpha-actinin, vinculin, and MAPK show a cell-specific localization indicating a role during restricted trophoblast invasion. The constitutive expression of integrins and the specific modulation of ECM proteins as well as the in vitro accumulation of cytoskeleton-associated proteins following adhesion of osteopontin suggest a functional role for osteopontin during implantation and placentation of sheep. Since bovine placentomal TGC are characterized by a specific expression of integrin receptors and ECM components, which is similar to the one of tumor cells, we may hypothesize that these proteins are relevant for TGC migration. The specific modulation of sheep connexins in response to pregnancy and around parturition indicates that the trophoblast in sheep is more invasive than in non-invasive epitheliochorial placental types. Bovine placentomal TGC coexpress epithelial and mesenchymal connexins, a fact supporting the idea that cows are representing an intermediate status between invasive and non-invasive placentation. The bovine placental vasculature is characterized by the establishment of an efficient feto-maternal exchange unit, embedded in fetal villous trees and maternal crypts. In early pregnancy, fetal and maternal vessels meet each other in a countercurrent fashion, whilst in the second half of gestation, a crosscurrent system develops, due to the progressing growth of capillaries. The adaptation of fetal and maternal placental blood vessels to hypobaric hypoxia by angiogenesis resulting in an increased exchange surface is shown in near term sheep placentomes. In bovine placentomes, the specific localization of FGFs in cells of the vasculature and immature TGC suggests their involvement in placental angiogenesis and TGC differentiation and migration. The prepartal switch from FGF expression in the epithelia to maternal stroma indicates programming for the regression of the uterus after parturition. The intermediate status of bovine TGC, which is also proposed due to connexin expression, is corroborated by the parallel occurrence of mesenchymal FGF1 and FGF2 and epithelial FGF7. The presence of FGFs and their receptors not only the cytoplasm but also in nuclei of bovine placental cells suggests auto- and/or intracrine functions. Taken together the presented results support the hypothesis that the restricted trophoblast invasion in the bovine placenta may serve as a model for other invasive processes. However, further studies, including the establishment of an in vitro cell culture system, are needed for a final judgement and the subsequent application of this model.