Darstellung apoptotischer und nekrotischer Rattenhepatozyten im Gewebeschnitt nach verschiedenen Fixierungsverfahren und mittels unterschiedlicher Nachweismethoden
1. Die Nachweismethoden H&
E-Färbung (Standard H&
E- und alkoholische H&
E-Färbung), Terminal DeoxynucleotidylTransferase-mediated dUTP Nick End-Labeling (TUNEL-Methode) und die Eosinfluoreszenz wurden zum Apoptosenachweis anRattenlebergewebe herangezogen. Hierfür wurde ein Apoptoseinduktionsmodell nach BURSCH et al. (1984; 1985; 1986) verwandt. DasGewebe wurde zwischen 1 und 92 Tagen rein in Formaldehyd, einen Tag in Formaldehyd fixiert und anschließend für die angegebene Zeitin Alkohol überführt oder in Carnoy fixiert. Zur Spezifitätskontrolle wurde ermittelt, inwieweit nekrotische Zellen oder andere unerwünschteStrukturen gleichfalls erfasst wurden.
2. Standard H&
E- und alkoholische H&
E-Färbung:
Um die geringsten Schwankungen der Werte auch bei archiviertem Nassmaterial zu erhalten, ist die Auswertung von Studien imStandard-Lichtmikroskop an Standard-H&
E-Schnitten nach einer reinen Fixierung in Formaldehyd zu empfehlen. Sowohl bei derRoutinefixierung (1 Tag) als auch beim Einsatz an Archivmaterial wurden hierbei basierend auf morphologischen Kriterien die geringstenSchwankungen der Apoptose-Indizes erhalten. Bei den einen Tag Formaldehyd-fixierten und anschließend in Alkohol verbrachten Organenerwiesen sich die Daten als unzuverlässiger als nach reiner Formaldehyd-Fixierung. Die Carnoy-Fixierung in Kombination mit der0,4%igen alkoholischen H&
E-Färbung hat bei standard-lichtmikroskopischer Auswertung das Ziel einer schnellen und si-cherenAuswertung nicht erreicht.
3. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End-Labeling (TUNEL)
Im Vergleich zu der Standardmethode (Standard-H&
E-Färbung) wurden mit der TUNEL-Methode höhere Apoptose-Indizes erhalten,allerdings mit einer breiteren Streuung der Daten. Mit einer Reduktion der Markierung bei längerer Fixierung und einer Reduktion derFärbeintensität, besteht beim Einsatz an Archivmaterial ein größerer Unsicherheitsfaktor als bei der Standard-H&
E-Färbung. Es tratensehr starke nicht-hepatozelluläre TUNEL-positive Signale auf und nekrotische Zellen wurden zu 22%-40% ebenfalls markiert. Die zusätzlichnotwendige morphologische Kontrolle ließ somit keine unkritische Auswertung der positiven Signale zu und schränkt den Einsatz einesrechnergestützten Bildanalysegerätes erheblich ein. Wurden die Lebergewebeproben nach einem Tag in Formaldehyd-Fixierunganschließend in Alkohol aufbewahrt, wurden die höchsten AI erhalten, allerdings mit dem Nachteil breiterer 95%iger Vertrauensbereicheder Mittelwerte als bei reiner Formaldehyd-Fixierung und somit unzuverlässigerer Daten.
4. EosinfluoreszenzBei der Fluoreszenz-Methode wiesen die Quotienten der Anstiegsfaktoren beider Dosisgruppen (der Anstiegsfaktor entspricht demAnstieg des AI von der Kontrolle auf den AI der jeweiligen Dosisgruppe) gegenüber der TUNEL-Methode weniger breite Streuungen aufund die AI entsprachen nach eintägiger Fixierung in etwa den Standard-H&
E-Daten. Trotzdem kann der Einsatz derFluoreszenzmikroskopie an Archivmaterial nicht befürwortet werden, da bereits nach siebentägiger Fixierung die Apoptose-Indizeserheblich reduziert waren und nach vierwöchiger Fixierung die AI weiter reduziert wurden. Das Auffinden der AB nach einem Tag Fixierungwird anhand der Fluoreszenzmikroskopie allerdings erheblich erleichtert (STINCHCOMBE, 1996). Nekrotische Zellen wiesen ebenfallseine Fluoreszenz auf. Ebenso wurden fluoreszierende Strukturen (FS) ermittelt, die nicht der Apoptose zugeordnet werden konnten. Daeine morphologische Kontrolle aufgrund der schwachen Färbung (alkoholische H&
E-Färbung) kaum möglich war, wird insbesondere derEinsatz der Fluoreszenz-Methode an Material, das länger als sieben Tage fixiert wurde, nicht empfohlen.
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