Site-directed Mutagenese von epidemischen Antibiotikaresistenz-Plasmiden zum Verständnis ihrer Erfolgsstrategien

Abstract

Die Resistenz gegen Antibiotika ist eine weltweite Herausforderung und es werden dringend neue Wege gesucht, diese zu bekämpfen. Für die Verbreitung dieser Resistenzen spielen Plasmide eine wichtige Rolle. Sie kodieren Resistenzgene gegen Breitbandantibiotika und besitzen, aufgrund ihrer Fähigkeit sich in einer Vielzahl klinisch relevanter Bakterienarten und Umgebung zu replizieren, ein breites Wirtsspektrum. Daher war das Ziel dieser Arbeit zwei Modellplasmide der Inkompatibilitätsgruppen N und X4, die Resistenzgene gegen Colistin und Carbapenemasen kodieren, zu untersuchen, mit dem Ziel beweisen zu können, dass diese Plasmide ihrem Wirt einen gewissen Vorteil verschaffen können und neue mögliche Targets zur Entwicklung neuer Antibiotika auf Plasmidebene zu finden. Dazu sollten vom Modellplasmid pCF13069 (IncN) Deletionsmutanten mittels des Lambda-Red-Rekombinase Verfahren erzeugt werden, wozu, aufgrund seiner vielen Resistenzen, zunächst das pKD4 Plasmid umkloniert wurde. Die Generierung der Mutanten war anschließend nicht erfolgreich. Vermutlich wurde hier das ursprüngliche Plasmid mit dem Zielgen und dem deletierten Gen verschleppt, sodass keine reinen Deletionsmutanten erzeugt werden konnten. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die zu deletierenden Bereiche essenziell für das Plasmid sein könnten. Im Modellplasmid pV163M (IncX4) wurde das hypothetische Protein P9 untersucht. Dazu wurde zunächst die Komplementation von p9 in pUC19 und pACYC184 durchgeführt, welche jedoch nur in pUC19 erfolgreich, aber unstabil war. Das Protein P9 konnte anschließend auch auf Proteinebene mittels MALDI-TOF-MS und SDS-PAGE nachgewiesen werden. Für die Durchführung einer Site-directed-Mutagenese wurde eine In silico Analyse durchgeführt, um geeignete Stellen im p9 Gen zu finden. Es konnte eine 68%ige Übereinstimmung mit dem, in Gram-positiven Bakterien vorkommenden, CopG Protein gefunden werden. Da dieses ein Kopienzahl-Regulator ist, kann davon ausgegangen werden, dass p9 ebenfalls für die Kontrolle der Plasmid-Kopienzahl in pV163M verantwortlich ist. Nach einem Vergleich der Proteinsequenzen wurden Einfach-, Doppel- und Dreifachmutanten in pUC19 und pV163M erzeugt. Die Aminosäuren Histidin, Prolin und Arginin wurden an den Positionen 56, 57 und 58 gegen die Aminosäure Alanin ausgetauscht. Die Charakterisierung der Mutanten wurde mittels Wachstumsanalyse und Konjugationsversuchen durchgeführt. Da die Mutante P58A ein ähnliches Wachstum zeigte wie die Komplementante, kann davon ausgegangen werden, dass die Aminosäure Prolin an der Position 58 keinen Einfluss auf die Funktionalität von p9 nimmt.