Die Auswirkung von Umwelteinflüssen auf die mRNA Stabilitäten in Rhodobacter sphaeroides : Globale Untersuchungen der mRNA Halbwertszeiten unter aeroben, microaeroben und phototrophen Wachstumsbedingungen

Abstract

Ein wichtiger Schritt der Genexpression findet auf Ebene der posttranskriptionalen Regulation durch Prozessierung und Degradation von RNA statt. Die Zeit, in der eine messenger RNA der Zelle zur Translation zur Verfügung steht hat einen maßgeblichen Einfluss auf die Menge des kodierten Proteins. So eröffnet eine Einflussnahme auf die Stabilität eines Transkriptes dem Organismus eine weitere Möglichkeit, sich optimal an seine Umwelt anzupassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein transkriptomweiter Vergleich der Halbwertszeiten von über 4000 Transkripten im Alphaproteobakterium Rhodobacter sphaeroides durchgeführt. Hauptaugenmerk lag dabei auf der Betrachtung der Unterschiede, die sich aus den drei Wachstumsbedingungen aerob, microaerob und phototroph ergaben. Hierfür wurden drei Transkriptomchips erstellt um die RNA von R. sphaeroides Kulturen zu untersuchen, die unter den genannten Bedingungen angezogen wurden und deren Transkription durch das Antibiotikum Rifampicin unterbunden wurde. Durch diese Methode konnten von 1461 Transkripten aus den aerob gewachsenen Kulturen Halbwertszeiten bestimmt werden. Für die microaeroben Kulturen gelang dies von 2222 Transkripten und für die phototrophen Kulturen von 2353 Transkripten.Die errechneten Halbwertszeiten lagen dabei in einem Bereich zwischen weniger als fünf Minuten und über einer Stunde. Der Median der Halbwertszeiten lag je nach Bedingung zwischen 21 und 22 Minuten. Damit sind die Transkriptshalbwertszeiten in R. sphaeroides bei globaler Betrachtung deutlich länger als in bisher untersuchten Prokaryoten und liegen in etwa im Bereich der mRNA Halbwertszeiten des Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae. So lange Halbwertszeiten sind für einige Transkripte in R. sphaeroides bekannt, dennoch ist ein methodischer Einfluss hier wahrscheinlich, da eine Überprüfung einiger ausgewählter Transkripte mittels qRT PCR und Northern blot kürzere Halbwertszeiten ergaben. Nichtsdestotrotz zeigten die Halbwertszeiten unter verschiedenen Bedingungen dieselben Tendenzen undabhängig von der Methode.Aus diesem Ergebnis kann auch geschlossen werden, dass unterschiedliche Wachstumsbedingungen nicht zu einer gleichmäßigen Stabilisierung bzw. Destabilisierung des gesamten Transkriptoms führten.Für eine nähere Untersuchung, ob die Transkripthalbwertszeit mit der Funktion des Genproduktes in Zusammenhang steht und ob die Wachstumsbedingung darauf einen Einfluss hat, wurden alle Gene von R. sphaeroides in funktionelle Kategorien eingeteilt. Auch hier zeigten sich keine Unterschiede in den Medianwerten der Halbwertszeiten in den einzelnen Kategorien unter einer Bedingung. Verschiedene Wachstumsbedingungen veränderten den Medianwert einer Kategorie ebenfalls nur geringfügig.Bei Betrachtung der Verteilung der Halbwertszeiten in den einzelnen Kategorien zeigte sich, dass im Vergleich zu microaeroben Bedingungen sowohl phototrophe als auch aerobe Wachstumsbedingungen in vielen Kategorien zu mehr Transkripten mit kurzen Halbwertszeiten und auch zu mehr Transkripten mit langen Halbwertszeiten führten. Die Verteilung der Halbwertszeiten war unter phototrophen und aeroben Bedingungen dennoch überwiegend gleich. Die deutlichsten Unterschiede zwischen den Wachstumsbedingungen zeigten sich letztendlich aber bei nur relativ wenigen Transkripten. So wiesen insgesamt sieben bis acht Prozent aller untersuchten Transkripte unter jeweils zwei verglichenen Bedingungen bezüglich ihrer Halbwertszeit einen deutlichen Unterschied von einem Faktor 2 auf. Unterschiedliche Wachstumsbedingungen führen in R. sphaeroides also nicht zu einer globalen Veränderung der Transkriptstabilitäten. Auch sind dadurch keine ganzen funktionellen Kategorien an Genen gleichmäßig betroffen. Sehr wohl aber sind einzelne Transkripte in vielen Kategorien zum Teil sehr stark in ihrer Stabilität durch unterschiedliche Wachstumsbedingungen verändert. Diese Arbeit legt den Grundstein zur Analyse, in welchem Umfang eine Genregulation in R. sphaeroides über die Veränderung von Transkriptstabilitäten stattfindet und ist Basis für weitergehende, zukünftige Untersuchungen. An important step in gene regulation takes place at post-transcriptional level by processing and degradation of RNA. The time a messenger RNA molecule is available for translation has a fundamental influence on the amount of the encoded protein. Taking influence on the stability of a transcript opens up an additional possibility for an organism to optimally adapt to its environment. In the past it has already been shown that the half life of a transcript may change under different environmental conditions.A transcriptome wide investigation of half lives of over 4000 transcripts of the alphaproteobacterium Rhodobacter sphaeroides was performed with the aim to get a deeper understanding how these half lives may change under aerobic, microaerobic and phototrophic growth conditions. For this purpose three custom microarrays for R. sphaeroides were used to analyze the RNA of cultures grown under the aforementioned conditions and whose transcription was arrested by the addition of rifampicin. By this method the half life of 1461 trancsripts of the aerobically grown cultures, of 2222 transcripts of the microaerobically grown cultures and of 2353 transcripts of the phototrophic cultures could be calculated.The half lives were in a range from under five minutes to over an hour. The median half lives were around 21 to 22 minutes, depending on growth condition. By this the calculated half lives are much higher than could be expected and which are described for prokaryotes and are in the dimension of the eukaryote Sacchoromyces cerevisiae. Trancripts with this kind of longevity are known in R. sphaeroides. However, a methodical influence is likely as the half lives of several chosen transcripts were much lower when estimated via qRT PCR or northern blot analyses, albeit the ratio of the half lives under different conditions were the same with all methods. Nonetheless this result infers that different environmental conditions do not lead to an even stabilization or destabilization of the whole transcriptome.For a closer examination to what extent the stability of the transcript and the function of the gene product are related and if the growth conditions have an effect on this relation, all genes of R. sphaeroides were clustered into functional categories. No differences in the median half lives could be observed between these functional categories and furthermore different growth conditions had also no clear influence on the median of the half lives in individual categories. The distribution of half lives in individual categories showed that in comparison with microaerobic conditions both aerobic and phototrophic conditions led to more transcripts with short as well as more transcripts with long half lives. However, in comparison aerobic and phototrophic conditions showed no clear difference in the distribution of half lives. The most distinct differences between the half lives under the compared growth conditions could be observed amongst only a smaller number of transcripts. Ultimately, of all investigated transcripts seven to eight percent of all transcripts of each compared condition showed a marked, at least two-fold difference in half life. Put together, different growth conditions do not lead to a general, global stabilization or destabilization of transcript stabilities in R. sphaeroides. Also no functional categories of genes are evenly affected by different environmental conditions. Nevertheless, individual transcripts in many different functional categories are strongly affected in their stability by different growth conditions.This work is the basis for future research to what extent gene regulation in R. sphaeroides is achieved by altering transcript stabilities in answer to different environmental conditions.