Für das Verständnis der Herzentwicklung und deren pathologischen Veränderungen ist die Identifikation von Genen und Signalwegen, welche die Kardiomyogenese kontrollieren notwendig. Die Kardiomyozyten stellen den zellulär größten Anteil am Herzen und bilden damit den Fokus der hier beschriebenen Analysen. Als Modell für die frühe Differenzierung von Kardiomyozyten wurden ES-Zell-abgeleitete Kardiomyozyten generiert. Die Differenzierung und Anreicherung wurde in Suspensionskultur unter horizontaler Rotation über die Bildung von Embryoid Bodies (EBs) und anschließender positiver genetischer Selektion der Kardiomyozyten über eine herzspezifische Antibiotikaresistenz bewerkstelligt. Die Identifikation von Genen, die essentiell für die Entwicklung und Differenzierung ES-Zell-abgeleiteter Kardiomyozyten sind, wurde mithilfe eines funktionellen Screens geleistet. Dieser basiert auf einer lentiviralen siRNA Bibliothek mit einer Komplexität von 178.000 individuellen siRNA-Klonen gegen 40.000 putative mRNAs. Jede mRNA wird somit von 3-5 verschiedenen siRNAs abgedeckt. Die Sequenzen der siRNAs korrespondieren mit den Sonden eines Affymetrix-DNA-Microarrays und ermöglichte somit die Identifikation der individuellen siRNAs in einer heterogenen Population. Es wurde eine stabile, konstitutiv siRNA- exprimierende ES-Zellpopulation mittels lentiviraler Transduktion und anschließender positiver Selektion infizierter Klone hergestellt. Als funktionelle Kontrolle diente die siRNA-vermittelte Suppression der Gata4-Aktivität, welche die kardiomyozytäre Differenzierung in vitro verhindert. An jedem Differenzierungschritt wurden die siRNA-Sequenzen isoliert, amplifiziert und mit Affymetrix-DNA-Microarrays hybridisiert. Die Identifikation der enthaltenen siRNAs jeder Population und deren korrespondierenden Zielgenen wurde mithilfe eines komplexen bioinformathischen Algorithmus geleistet. Die Isolation der für die kardiomyozytäre Differenzierung essentiellen Kandidaten erfolgte über die Bildung von Schnittmengen und dem anschließenden Abgleich mit den Transkriptomen von ES-Zell-abgeleiteten Kardiomyozyten, murinen embryonalen Herz Stadium E8,5 und isolierten murinen neonatalen Kardiomyozyten. Die Validierung der differenzierungs-hemmenden Wirkung der isolierten siRNAs, sowie das Ausmaß ihrer genspezifischen Unterdrückung erfolgte für einige siRNAs im Einzelansatz in vitro. Einige der im Screen identifizierten Kandidaten wurden bereits im Tiermodell als Effektoren der Herzentwicklung beschrieben, interferieren aber nicht notwendigerweise mit der kardiomyozytären Entwicklung. Die bioinformatische Clusteranalyse der Kandidaten erlaubte die Identifikation angereicherter Signalwege und kaskaden, Annotationsknoten nach GO (Gene Ontology), sowie von Genen unbekannter Funktion. Im Rahmen dieser Analyse wurde einige Signalwege und kaskaden, darunter auch Komponenten der Wnt- und Bmp-Signalgebung isoliert, die bereits als einflußnehmend auf die Herzentwicklung und Differenzierung beschrieben wurden. Interessanterweise wurden in dem siRNA-Screen sowohl Komponenten der kanonischen ß-catenin abhängigen als auch alternativen Wnt-Signalgebung, Wnt/Ca2+ and Wnt/PCP identifiziert. Diese Tatsache legt ein bislang noch nicht charakterisiertes Zusammenspiel dieser Signalwege in der frühen Kardiogenese nahe. Neben der zuvor beschriebenen Anreicherung von Faktoren der Signaltransduktion offenbart die GO-Cluster-Analyse einen signifikanten Einfluß von Genen, die mit Ionentransport assoziiert werden auf die Kardiomyozytäre Differenzierung in vitro. Hier sind haupsächlich Proteine, welche den Transport metallischer Ionen, wie Kalium, Natrium und Kalzium gewähleisten angereichert. Einige dieser Proteine wurden bereits mit Mutationen assoziiert, die arrythmische Erkrankungen, wie das LQT- und Brugada-Syndrom zur Folge haben.Insbesondere ermöglicht die Identifikation von Komponenten des Kalziumtransports eine Verbindung zu der Wnt/Ca2+- Signalgebung. Diese Verbindung bildet die Basis zukünftiger Analysen zur weiteren Aufklärung der Rolle von Kalzium, dessen Transport und einflußnehmender Regulationsmechanismen, wie z. B. der Wnt-Signalgebung, im Kontext der kardiomyozytären Differenzierung in vitro und in vivo.
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