Anwendung von Staphylococcus aureus Protein A in Kombination mit rekombinanten Antikörperfragmenten zur zielgerichteten Listeria monocytogenes Infektion in malignen Zellen und deren spezifische Schädigung durch Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A

Abstract

Die Therapie maligner Erkrankungen ist aufgrund der klinischen Relevanz Gegenstand der Forschung. Ein Therapieansatz ist die Verwendung von Bakterien in der Krebsthe-rapie. Listeria monocytogenes ist aufgrund seiner Fähigkeiten viele Zellarten zu infizie-ren und eine starke adaptive Immunantwort zu erzeugen gut für diese Art von Therapie geeignet. In dieser Arbeit wurde der Therapieansatz verfolgt, Krebszellen gezielt mit L. monocytogenes zu infizieren. Hierzu wurde das Protein A (SPA) aus Staphylococcus aureus auf der Zellwandoberfläche von L. monocytogenes produziert. SPA ist ein Oberflächenprotein, das Antikörper an deren konstanten Fc-Fragment bindet. So bleibt der variable Teil des Antikörpers in der Lage, Antigene zu binden. Anschließend wur-den als Antikörperäquivalente rekombinante scFv-Fc-Fusionsproteine verwendet, die aus einem konstanten Fc-Fragment sowie zwei single chain variable fragments (scFv) bestehen. Diese gegen auf Krebszellen überexprimierte Oberflächenantigene gerichte-ten scFv-Fc-Fusionsproteine wurden über SPA auf der Zellwandoberfläche von L. mo-nocytogenes gebunden. Anschließend erfolgte die Infektion von zwei verschiedenen Krebszelllinien. CD30 exprimierende Zellen eines Hodgkin Lymphoms (KM-H2) wurden gezielt und unabhängig von Internalin A und B mit L. monocytogenes in Kombination mit dem gegen CD30 gerichteten Ki-4-scFv-Fc-Fusionsprotein, das über SPA gebun-den wurde, infiziert. Weiterhin erfolgte der Nachweis einer spezifischen, Internalin un-abhängigen Infektion von L. monocytogenes in einer Zelllinie eines kleinzelligen Bron-chialkarzinoms (DMS-273) in Kombination mit SPA und einem gegen ein unbekanntes Zielantigen gerichteten scFv-Fc-Fusionsprotein. Um die spezifisch infizierten Krebszel-len zu schädigen, wurde Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa in L. mono-cytogenes unter der Kontrolle des intrazellulär stark exprimierten actA Promotors pro-duziert. ETA bindet an den eukaryotischen Elongationsfaktor 2, inhibiert so die Pro-teinbiosynthese und sorgt für eine Apoptose der eukaryotischen Zelle. Der Nachweis einer erhöhten Toxizität der Toxin-produzierenden Bakterien erfolgte in Makrophagen der Zelllinie P388D1. Zudem wurden KM-H2 Zellen mit gezielt mit L. monocytogenes infiziert, die sowohl SPA auf ihrer Oberfläche exprimieren als auch ETA sezernieren. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Kombination dieser Bakterien mit dem spe-zifisch gegen die zu infizierenden Krebszellen gerichteten scFv-Fc-Fusionsprotein zu einer deutlichen Steigerung der Apoptoseaktivität der untersuchten Zellen führt.