Ein biotechnologischer Ansatz zur Produktion von Aromaextrakten mit der Geruchsqualität pilzig wurde auf Basis der submersen Kultivierung von Lentinula edodes (Trivialname Shiitake) und anschließendem Aufschluss des Myzels entwickelt. Die Bildung von Aromastoffen wurde anhand der Gehalte des Schlüsselaromastoffs Oct 1 en 3 ol in den Homogenaten des Myzels beurteilt. Als Parameter für das Wachstum des Pilzes wurde die Trockenmasse bestimmt. Das Medium der Hauptkultur wurde schrittweise optimiert, um die an der Aromabildung beteiligten Enzyme zu induzieren, und zudem vereinfacht, um Kosten einzusparen. Zusätzlich wurde die Dauer der Hauptkultur unter Steigerung der Ausbeute an Oct 1 en 3 ol um zwei auf acht Tage verkürzt. Die Bildung der Aromastoffe nach Aufschluss des Myzels wurde untersucht und der Prozess optimiert. Insbesondere der Einfluss des precursors Linolsäure sowie die Auswirkung der Inkubationszeit der Homogenate wurden ermittelt. Der Zusatz von Linolsäure sowie eine Inkubationszeit von bis zu 30 min bewirkte eine signifikante Steigerung der Gehalte an Oct 1 en 3 ol. Unter optimalen Bedingungen wurden mit etwa 6.200 µg Oct 1 en 3 ol g-1 Trockenmasse Myzel bzw. 35 mg Oct 1 en 3 ol L-1 Transformationsansatz die höchsten bislang für submers kultivierte Basidiomyceten berichteten Gehalte erzielt. Das gebildete Oct 1 en 3 ol weist einen Enantiomerenüberschuss (% ee) von über 90% bis zu 93% zugunsten des erwünschten R-(-)-Enantiomers auf.Das Aromaprofil des submers kultivierten Myzels von L. edodes wurde vergleichend unter enzyminhibierenden und enzymaktivierenden Bedingungen untersucht. Dazu wurden mittels Flüssig-flüssig-Extraktion (LLE) mit anschließender solvent-assisted flavour evaporation (SAFE) sowie durch headspace solid-phase microextraction (HS SPME) Aromaextrakte aus homogenisiertem Myzel gewonnen. Die Identifizierung der geruchsaktiven Stoffe in den Extrakten erfolgte mittels Gaschromatographie-Olfaktometrie (GC-O) und Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC MS). Das Aromaprofil des unter enzymaktivierenden Bedingungen aufgeschlossenen Myzels war geprägt durch C8-Aromastoffe und S haltige Verbindungen.Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung und Isolierung der Hydroperoxidlyase (HPL), welche die Spaltung von 10-Hydroperoxy-octadeca-8(E),12(Z)-diensäure (10 HPOD) zu Oct 1 en 3 ol und 10 Oxo-dec 8(E) ensäure katalysiert. Als Vorarbeit wurde 10-HPOD über eine Photooxygenierung von Linolsäure synthetisiert und mittels Dünnschicht-chromatographie, NMR sowie nach Derivatisierung mittels GC-MS analysiert. Zudem wurde die Bildung von 10-HPOD in submers kultiviertem Myzel nachgewiesen, was den aus Fruchtkörpern von Basidiomyceten bekannten Biosyntheseweg von Oct 1 en 3 ol bestätigt.Ein spezifischer Assay für die HPL-Aktivität wurde durch Bestimmung des Produktes Oct 1 en 3 ol mittels HS-SPME-enantio-GC-MS entwickelt und erlaubte anhand des Enantiomerenverhältnisses und geeigneter Kontrollen die Unterscheidung zwischen enzymatischer Umsetzung und spontanem Zerfall des Substrates 10 HPOD. Der Assay wurde für die aktivitätsgeleitete Isolierung der HPL eingesetzt.Im Überstand der Submerskultur von L. edodes wurde keine HPL-Aktivität festgestellt und somit eine Sekretion des gesuchten Enzyms ausgeschlossen. Daher erfolgte die Reinigung aus Myzel und Fruchtkörpern. Durch mechanischen Zell¬aufschluss wurde das Enzym freigesetzt und das Homogenat mittels Ultra-zentrifugation separiert. Die HPL-Aktivität wurde im Pellet (Mikrosomenfraktion), aber nicht im Überstand der Ultrazentrifugation nachgewiesen. Folglich handelt es sich nicht um ein lösliches Protein, sondern vermutlich um ein Membranprotein. Das Enzym wurde unter Verwendung des nichtionischen Detergens Saccharosemonolaurat (SML) solubilisiert. Für die Reinigung der HPL aus dem Extrakt mittels Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) erwiesen sich die Anionenaustauschchromatographie sowie die Gelfiltrationschromatographie (SEC) als geeignete Trenntechniken. Für das Enzym mit HPL-Aktivität wurde mittels Gelfiltrationschromatographie ein apparentes Molekulargewicht im Bereich von 42 kDa bis 66 kDa ermittelt. Als finale Reinigungsstrategie wurden die SEC und Ionenaustauschchromatographie kombiniert. Nach der Reinigung wurde geringe HPL-Aktivität nachgewiesen und mittels SDS-PAGE mit kolloidaler Coomassie-Färbung wurden zwei Proteinbanden mit Molekulargewichten von 62 kDa bzw. 55 kDa detektiert.Die Banden wurden Partnern zur Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF-MS sowie zur de novo-Sequenzierung nach tryptischem Verdau mittels ESI-MS/MS übergeben. Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Proteinanalytik führten jedoch weder zu Übereinstimmungen mit bekannten Proteinen noch wurden mit den generierten Sequenzen Treffer in den verfügbaren Basidiomyceten-Genomen erhalten. Die erfolgreiche Messung von HPL-Aktivität in der gereinigten Proteinlösung zeigt jedoch die Eignung der Reinigungsstrategie.
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