Functional Characterization of a Novel Slow Muscle-Specific Methyltransferase - Mettl21c

Abstract

Die Skelettmuskulatur dient nicht nur der Bewegung und Kraftproduktion, sondern sie stellt das größte Aminosäure- und Kohlenhydratreservoir im Körper dar. Die Balance des Aminosäurestoffwechsels im Muskel spielt eine wichtige Rolle für den gesamten Organismus. Die Skelettmuskulatur ist in der Lage schnell auf viele physiologische Impulse, wie Veränderung der Ernährungsgewohnheiten, hormonelle Stimulation, kontraktile Aktivität und körperliche Beanspruchung zu reagieren. Diese Flexibilität des Skelettmuskels wird durch unterschiedliche Proteinklassen und ihre reversiblen post-translationalen Modifikationen (PTMs) reguliert. Ein Charakteristikum des Skelettmuskels sind die unterschiedlichen Fasertypen, die für ausdauernde oder schnelle Kontraktionen ausgelegt sind. In der Tat zeigen Muskelfasern zelltyp-spezifische Regulationen und reagieren unterschiedlich auf Umweltveränderungen.Der Schwerpunkt dieser Dissertation war die Charakterisierung der potentiellen Methyltransferase Mettl21c, welche primär in langsamen Muskelfasern exprimiert wird. Die Inaktivierung von Mettl21c in Mäusen durch homologe Rekombination konnte zeigen, dass Mettl21c den autophagosomalen-lysosomalen Signalweg reguliert. Es ist jedoch völlig unklar, wie Protein-Methylierungen die Proteolyse in unterschiedlichen Fasertypen reguliert.Vorherige Studien zeigten, dass Methylierungen von Proteinen die Interaktionen, die Proteinstabilität und aktivität, sowie den Protein-Turnover und die zelluläre Lokalisation beeinflussen können. Folglich wird eine Fehlregulation von Methylierungsmustern mit der Pathologie vieler bekannter humaner Krankheiten wie Krebs, metabolischen, inflammatorischen und neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert. Kürzlich wurde die METTL21 Familie als neue Klasse I Methyltransferasen identifiziert, die vorzugsweise Chaperone wie HSP70 und Valosin-containing protein (VCP, auch bekannt als p97 und cdc48) ansteuert und reguliert. Dies bringt die METTL21 Familie in direkten Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Einschlusskörper-Myopathie assoziiert mit einem M. Paget der Knochen und einer frontotemporalen Demenz (IBMPFD - inclusion body myopathy associated with Paget disease of the bone and frontotemporal dementia) sowie familiären Formen der amyotrophischen Lateralsklerose.Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass Mettl21c stark in langsamen Muskelfasern exprimiert wird. Mettl21c ist in der Z-Scheibe lokalisiert, in der sich viele Signalproteine befinden, die vor allem die Muskelhomöostase regulieren. Die Deletion des Mettl21c Gens in Mäusen verursacht eine massive Abnahme der Skelettmuskelleistung, was klar auf Störungen des Muskelstoffwechsels hindeutet. Eine pathologische Fehlregulation des autophagischen Flusses beeinträchtigt den Stoffwechsel des Skelettmuskels bei körperlicher Anstrengung. Um die molekulare und zelluläre Funktion von Mettl21c genauer zu untersuchen, wurden quantitative Protein-Protein-Interaktionsstudien basierend auf massenspektrometrischen Analysen durchgeführt. Diese Experimente zeigten eine starke Interaktion zwischen Mettl21c und mehreren Chaperonen, darunter Valosin-containing protein (Vcp). Vcp wird eine zentrale Rolle bei der Reifung der Autophagosomen und Fusion mit Lysosomen zugesprochen. Somit könnte Mettl21c eine Funktion bei der Regulation des Autophagie-Prozesses spielen. Morphologische Analysen mittels Elektronenmikroskopie zeigten eine Akkumulation von autophagosomalen Vakuolen in Mettl21c defizienten Muskeln. In-vitro Methylierungsassays und massenspektrometrische Analysen zeigten, dass Mettl21c Vcp am Lysin-315 trimethyliert. Diese Daten waren in Einklang mit einer verminderten Vcp Trimethylierung in langsamen Soleus Muskelfasern von Mettl21c-/- Mäusen. In einer vorangegangen Studie konnte gezeigt werden, dass eine Methylierung am Lysin-315 die ATPase/D1 Aktivität von VCP herabsetzt [2]. Zudem konnte eine verminderte Interaktion zwischen Vcp und dem inhibitorischen Kofaktor Nsfl1c in Mettl21c-/- Mäusen aufgezeigt werden. Nsfl1c ist als wichtiger Kofaktor für Vcp bekannt und eine reduzierte Interaktion erhöht vermutlich die ATPase Aktivität von Vcp. Ein Verlust der ATPase-Aktivität von Vcp führt zu neurodegenerativen Erkrankungen und hiermit verwandten Myopathien, vermutlich ausgelöst durch die Akkumulation toxischer Proteine.Durch diese Arbeit konnte ein wichtiger Beitrag zum Verständnis für die Regulation der Autophagie im langsamen Skelettmuskel durch das Zusammenspiel von Chaperonen wie Vcp, deren Kofaktoren und skelettmuskelspezifischen Methyltransferasen wie Mettl21c erbracht werden. In mammals the skeletal muscle is not only essential for movement and force production but comprises also a large reservoir of amino acids and carbohydrates. The maintenance of the muscle homoeostasis is therefore essential for the whole body metabolism. In addition, the skeletal muscle is highly adaptable and responds rapidly to physiological and environmental changes, including nutritional changes, hormonal stimulation, and work loading. This flexibility arises from the dynamic expression of signaling molecules and their reversible post-translational modifications (PTMs). Moreover, the skeletal muscle consists of specific fiber-types with different metabolic profiles designed for endurance and fast contraction. In fact, muscle fibers show cell-type specific regulations and they respond differently to environmental changes.The main focus of this thesis was the characterization of the putative methyltransferase Mettl21c which is highly expressed in slow type I muscle fibers. The inactivation of Mettl21c in mice by homologous recombination showed a clear association of Mettl21c to the skeletal muscle autophagosomal-lysosomal pathway. Notably, it is completely unclear how protein methylation regulates proteolysis in a fiber-type specific manner.Previous studies indicate that protein methylation can influence the interaction, stability, cellular localization, and activity of proteins. Furthermore, a dysregulation of protein methylation is linked to the pathology of cancer, metabolic, inflammatory and neurodegenerative diseases. Recently, the METTL21 family was discovered as a novel Class I family of lysine methyltransferases that preferentially target and regulate molecular chaperones such as HSP70 and Valosin-containing protein (VCP, also known as p97 and cdc48). In addition, the METTL21 family might play a role in neurodegenerative diseases like Inclusion Body Myopathy with Paget´s disease of bone and Fronto-temporal Dementia (IBMPFD) and some familial forms of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS).The presented study revealed that Mettl21c is highly expressed in slow-twitch muscle fibers and localized to Z-disk structures, which is not only a border of the sarcomere but also an important signaling hub to regulate muscle homeostasis. The inactivation of Mettl21c in mice causes a severe reduction in muscle performance, including voluntary and forced running, suggesting a vital function for Mettl21c in maintaining muscle activity. The pathological dysregulation of the autophagic flux interferes with the metabolism of the skeletal muscle during physical exertion. To better understand the molecular and cellular function of Mettl21c, comprehensive mass spectrometry based protein-protein interaction studies were performed and revealed a strong interaction between Mettl21c and several chaperones, including the Valosin-containing protein (VCP). This finding suggests that Mettl21c is associated to the autophagy system since VCP is a key regulator in the maturation of autophagosomes and fusion of lysosomes. Moreover, detailed morphometric analysis using electron microscopy showed a clear accumulation of autophagosomal vacuoles in Mettl21c deficient slow muscle fibers. In vitro methylation assays indicated that VCP is a direct substrate of Mettl21c and this was further confirmed by the mass spectrometric detection of Mettl21c dependent trimethylation sites (K315) of VCP. Consistently, Mettl21c deficient animals show reduced VCP trimethylation in slow soleus fibers, which might enhance the activity of the ATPase/D1 of VCP. Interestingly, the reduced trimethylation of Vcp in Mettl21c deficient slow muscle fibers resulted in a reduced interaction between Vcp and the inhibitory cofactor Nsfl1c (also known as p47). Nsfl1c is an important cofactor for Vcp and a reduced interaction might enhance the ATPase activity of Vcp leading to neurodegenerative diseases and related myopathies.In summary, the expression of a slow fiber-type specific methyltransferase might be a new mechanism to regulate the formation of autophagosomes and the interaction of Mettl21c-Vcp-Nsfl1c represents a new network to modulate protein homeostasis in slow skeletal muscle tissue.