In der Pathogenese endovaskulärer Infektionen wie z. B. der Endokarditis, spielt die Assoziation von Bakterien und Thrombozyten einewichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Aufklärung des Adhäsions-mechanismus von Staphylococcusaureus an Thrombozyten durchgeführt. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei sowohl auf die Identifizierung der für die Interaktionrelevanten Rezeptoren auf thrombozytärer und bakterieller Seite, als auch auf die Untersuchung von Plasmaproteinen als Brückenmolekülegelegt.
Für die durchflußzytometrische Untersuchung der S. aureus - Thrombozyten -Assoziation konnte eine Methode erarbeitet werden, bei derdie Markierung der Zellen es ermöglichte, Thrombozyten- und Bakterienpopulation in einem Durchflußzytometer mit nur einemAnregungslaser getrennt voneinander darstellen zu können und die Assoziate quantitativ zu erfassen.
Untersuchungen zur S. aureus-Thrombozyten-Assoziation lieferten Hinweise, daß die Bindung von S. aureus an Thrombozyten in Formeiner spezifischen Rezeptor-Liganden-Bindung verläuft, an der mehrere Rezeptoren bzw. Adhäsine beteiligt sind. Dabei ist derAktivierungszustand der Plättchen und die damit einhergehenden Veränderungen der Plättchen von entscheidender Bedeutung.
Assoziationsversuche in plasmafreiem und plasmahaltigem Milieu ergaben, daß die Anwesenheit von Plasmabestandteilen die Bindungvon S. aureus an Thrombozyten deutlich erhöhte. Dabei konnte die Zugabe von Fibrinogen oder des von Willebrand Faktors/Faktor VIII inAbwesenheit anderer Plasmabestandteile die Assoziationsrate signifikant steigern.
Mittels Fluorochrom-markierten Fibrinogens konnte eine spezifische Bindung von Fibrinogen an Thrombozyten und Bakterien gezeigtwerden.
Inhibierungsversuche mit Peptiden, welche die Bindung von Fibrinogen an Thrombozyten bzw. an S. aureus hemmen, konnten einedeutliche Reduzierung der Assoziationsrate zeigen. Hiermit ließ sich nachweisen, daß Fibrinogen als Brückenmolekül für die Bindung vonS. aureus an Thrombozyten dient, wobei sowohl die Bindung von Fibrinogen über die RGDS-Sequenz, als auch die Bindung vonFibrinogen an Thrombozyten und S. aureus über die Dodekapeptidsequenz von Bedeutung ist. Anhand durchflußzytometrischer Untersuchungen mit Protein A-, 'clumping factor'-, Koagulase-, und MAP-Deletionsmutanten konntenProtein A und der 'clumping factor', nicht jedoch Koagulase und MAP als Adhäsine für die Bindung von Fibrinogen in Suspension auf S.aureus nachgewiesen werden. Blockierungs-experimente mit einem inhibierenden Antikörper gegen Protein A konnten Protein A alsfibrinogenbindendes Adhäsin auf S. aureus bestätigen.
Die Reinigung und FITC-Markierung des von Willebrand Faktors (vWF) ermöglichte den Nachweis der spezifischen Bindung diesesProteins an Thrombozyten und Bakterien im Durchflußzytometer. Mit Antikörpern und deren F(ab´)2-Fragmenten, welche die Bindung des von Willebrand Faktors an die Thrombozyten bzw. an S. aureushemmen, konnte keine Inhibierung der Bindung von S. aureus an Thrombozyten erreicht werden. Untersuchungen eines Patienten mit 'vonWillebrand Disease' Typ3 und eines an Hämophilie A erkrankten Patienten gaben jedoch Hinweise auf eine Beteiligung sowohl des vonWillebrand Faktors als auch des Gerinnungsfaktors VIII an der S. aureus-Thrombozyten-Assoziation. Bindungsstudien an Protein A-Deletionsmutanten und Blockierungsexperimente mit einem anti-Protein-A-Antikörper imDurchflußyzytometer konnten Protein A als Adhäsin für die Bindung des von Willebrand Faktors auf S. aureus identifizieren.
Mittels durchflußzytometrischer Untersuchungen an Patienten mit Speicherfunktionsstörungen der Granula ('[alpha]-, [delta]-storage pooldisease' und 'Gray-platelet-syndrome') konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß die Proteine der [alpha]-Granula die Bindung von S.aureus an Thrombozyten vermitteln. Beide Patienten zeigten eine deutlich verminderte Assoziationsrate, welche sich auch durchAktivierung der Plättchen nicht erhöhen ließ.
Der Zusatz von gereinigtem Thrombospondin-1 (TSP-1) zu den Assoziationsversuchen mit Plättchen dieser Patienten brachte keineSteigerung der Assoziationsrate zwischen S. aureus und Plättchen. Dieses, im kalziumfreien Milieu in die nicht adhäsive Formübergegangene TSP-1, konnte als Brückenmolekül für die Bindung von S. aureus an Thrombozyten nicht nachgewiesen werden. Da dieadhäsive Eigenschaft von TSP-1 von dessen Konformitätszustand abhängt, konnte anhand der Experimente eine Rolle des TSP-1 alsBrückenmolekül jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Inhibierungsversuche mit Sialyl-Lewis-X, welches die Bindung von CD62 (P-Selektin) auf Plättchen an PSGL-1 hemmt, konnten keineVerminderung der Assoziationsrate zeigen. Assoziationsversuche an P-Selektin-knockout-Mäusen zeigten keinen Unterschied in derBindung von S. aureus an CD62-defiziente Plättchen und Kontrollplättchen. Eine Bindung von S. aureus über P-Selektin an Thrombozytenkonnte somit nicht nachgewiesen werden.
Die Untersuchung der Glykoproteine CD36 und GPIIb/IIIa wurde mit Plättchen von Patienten durchgeführt, denen diese Glykoproteinefehlen. In beiden Fällen zeig-ten die defizienten Plättchen eine mit Kontrollplättchen vergleichbare Assoziations-rate. Dies deutet darauf hin,daß CD36 und GPIIb/IIIa für die S. aureus-Thrombozyten-Assoziation nicht, oder nur von geringer Bedeutung sind.
Mittels Untersuchungen an Plättchen von Knockout-Mäusen der Fc[gamma]-Kette, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß dieFc[gamma]-Kette an der Bindung von S. aureus an Thrombozyten beteiligt ist. Die Plättchen der Knockout-Mäuse banden signifikantweniger S. aureus als Plättchen der Kontrolltiere.
In einem weiteren Teil der Arbeit konnte über den Aktivierungsmarker CD62 die Aktivierung von Thrombozyten durch S. aureusnachgewiesen werden. Die Aktivierbarkeit der Thrombozyten erwies sich als personenspezifisch. Blockierungsexperimente mit einem denFcRIIA-Rezeptor auf Plättchen inhibierenden Antikörper zeigten, daß die Plättchenaktivierung über diesen Rezeptor vermittelt wird. MittelsPCR konnte der Genotyp des FcRIIA-Rezeptors der untersuchten Personen bestimmt werden und gezeigt werden, daß die Aktivierbarkeitder Thrombozyten in Zusammenhang mit dem für diesen Rezeptor bekannten Polymorphismus steht. So wiesen Personen mit durch S.aureus aktivierbaren Thrombozyten hautsächlich den Genotyp FcRIIA-His/His131, Personen mit nicht aktivierbaren Plättchen den GenotypFcRIIA-Arg/Arg131 und Personen, mit nicht eindeutig aktivierbaren Plättchen den Genotyp FcRIIA-Arg/His131 auf. Weiterhin wurde der Genotyp des FcRIIA-Rezeptors von Patienten bestimmt, welche an einer S. aureus-Endokarditis erkrankt waren. ImVergleich zu gesunden Personen, zeigten diese Patienten deutlich vermehrt den Genotyp FcRIIA-Arg/Arg und waren damit mit der Gruppeder Personen vergleichbar, deren Thrombozyten sich nicht durch S. aureus aktivieren ließen. Dies könnte Anlaß zu der Vermutung geben,daß Personen dieses Genotyps eine Prädisposition für S. aureus-induzierte endovaskuläre Erkrankungen besitzen.
Untersuchungen über die Aktivierbarkeit der Thromboyzten durch S. aureus an GPIIb/III-defizienten Plättchen konnten eine Beteiligung desGlykoproteins IIb/IIIa ausschließen. Plättchen eines Patienten mit 'von Willebrand Disease' Typ3 ließen sich nach Substitution mitvWF/FaktorVIII aktivieren. Dies legt neben der Rolle des FcRIIa-Rezeptors die Beteiligung des vWF bzw. Faktor VIII nahe.
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