Untersuchungen zur Verbreitung und Funktion des äußere-Membran-Proteins OmpW von Salmonella spp.
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Zusammenfassung
Die Proteine der äußeren Membran von Salmonellen sind geeignete Targetstrukturen für diagnostische, therapeutische oder immunprophylaktische Anwendungen. Vor diesem Hintergrund war es Ziel der vorliegenden Arbeit, das Vorkommen des äußeren-Membran-Proteins W (OmpW) von Salmonella spp. erstmals systematisch zu untersuchen. Des Weiteren sollte mittels einer isogenen ompW-Knockout-Mutante beleuchtet werden, inwieweit OmpW ein essentieller Vitalfaktor für Salmonellen ist. Im Einzelnen sollte nach Hinweisen gesucht werden, welche biologische Bedeutung OmpW für Salmonellen hat und welchen Einfluss das Fehlen von OmpW auf die Fitness der Salmonellen unter verschiedenen Milieueinflüssen ausübt. Eine repräsentative Auswahl an 100 Salmonellen-Stämmen aus beiden Spezies, allen Subspezies und 19 verschiedenen O-Gruppen sowie 60 Bakterienstämmen aus 24 anderen Bakteriengenera wurden auf das Vorhandensein des Gens ompW mittels PCR und DNS-DNS-Hybridisierung untersucht. Das ompW-Gen ließ sich bei allen untersuchten Salmonella-Serovaren nachweisen. Es war bei allen untersuchten Stämmen chromosomal lokalisiert und stets im gleichen Genlokus zwischen den Genen stm1733 und katN organisiert. Immuno-Blot-Analysen mit einem eigens hergestellten OmpW-spezifischen Hyperimmunserum zeigten, dass OmpW in vitro von allen Salmonellen exprimiert wurde, allerdings schwankte das Expressionsniveau etwa um den Faktor zehn. Als einziger Salmonellen-Stamm konnte S. Marina SARC9 als natürliche ompW-Deletionsmutante identifiziert werden, die aufgrund einer 614 bp großen Deletion das OmpW-Protein nicht bilden kann. ompW-homologe Nukleotid-Sequenzen konnten auch in anderen Enterobakterien der Genera Escherichia, Shigella, Citrobacter, Klebsiella und Serratia detektiert werden. Die Hybridisierung der ompW-Gensonde mit chromosomaler DNS von Clostridium sporogenes NCTC532 in Dot-Blot- und Southern-Blot-Analysen deutet erstmals auf eine ompW-homologe Gensequenz bei einem Gram-positiven Bakterium hin. Nur bei den Salmonellen flankierten die Gene stm1733 und katN das ompW-Gen, so dass diese Anordnung nach bisherigen Analysen für Salmonellen spezifisch ist. Die Existenz der natürlichen ompW-Deletionsmutante SARC9 und die erfolgreiche Herstellung der ompW-Knockout-Mutante von Salmonella Typhimurium Stamm SL1344 zeigten, dass das Fehlen von OmpW für Salmonellen kein Letalfaktor ist. Der SL1344-Stamm und seine isogene ompW-Knockout-Mutante sowie die Deletionsmutante SARC9 und vier OmpW-positive S. Marina-Stämme wurden phänotypisch bezüglich ihrer Wachstumseigenschaften charakterisiert, um Hinweise auf die biologische Funktion von OmpW zu erhalten. Eine Bedeutung von OmpW für die Vitalität von S. Tm. konnte bei Anzuchtverfahren in Nährmedien mit hoher Osmolarität, niedrigem pH, limitiertem Eisenangebot oder oxidativem Stress nicht festgestellt werden. Ebenso war weder eine veränderte Sensitivität gegenüber den membrandestabilisierenden Detergentien Triton X-100 und Natrium-Dodecylsulfat noch gegenüber 24 verschiedenen Chemotherapeutika in Abhängigkeit von der OmpW-Expression festzustellen. Insbesondere konnte ein Einfluss von OmpW auf die Sensitivität der Salmonellen gegenüber Ampicillin, Tetrazyklin und Ceftriaxon mittels Agardiffusionstests und Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen im Mikrobouillondilutionstest widerlegt werden, obwohl derartige Eigenschaften für OmpW von S. Typhimurium beziehungsweise für OmpW-homologe Proteine anderer Bakterien vermutet worden waren. Anzuchtversuche mit den isogenen Salmonellen-Stämmen in M9-Ca-Mangelmedien lieferten erstmals Hinweise für einen Einfluss von OmpW auf das Wachstumsverhalten in Kohlenhydratmangelsituationen. Die Supplementierung von 2 % Natriumazetat führte zu einem leicht gesteigerten, der Zusatz von 0,6 % Di-Natrium-Succinat sogar zu einem etwa 40 % stärkeren Wachstum von SL1344 gegenüber seiner ompW-Knockout-Mutante. Hinweise auf eine Bedeutung von OmpW als bakterielles Adhäsin konnten anhand von Zellkulturversuchen nicht gefunden werden, wenngleich eine Funktion bei der Ausbildung von Virulenzeigenschaften für das OmpW-Homolog von Vibrio cholerae vermutet wird. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass OmpW Eigenschaften eines Porins besitzt und ein Fehlen von OmpW die Bereitstellung und damit die Metabolisierung der sekundären Kohlenstoffquellen Azetat und Succinat beeinträchtigt. OmpW könnte die äußere-Membran-Komponente eines Redoxsystems im Kohlenhydratstoffwechsel von Salmonellen sein. Eine derartige Funktion von OmpW würde auch gut die bei E. coli beobachtete Ausbildung von Proteinkomplexen zwischen OmpW, der Fumaratreduktase und weiteren Proteinen des Kohlenhydratstoffwechsels erklären.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008