Gastrointestinale Prozessierung und physiologische Bedeutung von Oligosacchariden der Humanmilch

Abstract

Ziel und Gegenstand der experimentellen Arbeiten: Die komplexen Oligosaccharide der Humanmilch (HMO) sind sowohl hinsichtlich ihrer Konzentration in der Milch als auch aufgrund ihrerstrukturellen Vielfalt einzigartig im Reich der Säuger. Weder über ihr Schicksal nach Aufnahme durch den Säugling noch über ihre biologischeFunktion besteht gegenwärtig Klarheit. In der vorliegenden Arbeit wurden daher folgende Aspekte näher untersucht: 1) die hydrolytische Stabilität derHMO im Gastrointestinaltrakt, 2) Art und Umfang der Resorption der HMO, 3) zellbiologische sowie 4) antiadhäsive Wirkungen der HMO. Untersuchungsmethoden und Befunde: Ad 1) Verschiedene aus Humanmilch isolierte Fraktionen von HMO wurden bis zu 20 Stunden mit Präparationen von Pankreas- undDünndarmgewebe inkubiert und enzymatisch sowie massenspektro-metrisch charakterisiert. Exemplarisch wurden im Tiermodell HMO an jungeMäuse intragastral verabreicht und deren Schicksal durch dünnschichtchromatographischen Nachweis in Faecesproben und Organen betrachtet.Sowohl die in vitro als auch die in vivo Untersuchungen ergaben, daß die HMO eine außergewöhnliche Stabilität gegenüber Hydrolasen desGastro-intestinaltraktes aufweisen. HMO können damit weitgehend unverändert den Dünndarm passieren und unterliegen erst im Dickdarm einerbakteriellen Hydrolyse. Die Oligosaccharide können aus diesem Blickwinkel als die lösliche Ballaststofffraktion der Humanmilch angesehen werden. Ad 2) Die intestinale Resorption von HMO wurde in Zellkulturmodellen des menschlichen Dünndarms und tierexperimentell an Mäusen untersucht.Die in vitro Versuche ergaben, daß HMO in einem Umfang von 2 bis 3 % der angebotenen Menge in intakter Form das Epithel von Caco-2 Zellenpermeieren können und dies überwiegend parazellulär erfolgt. Die ermittelten Resorptionsraten stimmen mit denen in Mäuse überein, bei welchendie HMO in geringem Umfang sowohl in der Leber als auch im Urin zum Teil noch in intakter Form nachgewiesen werden konnten. Ad 3) Die hohe Stabilität und geringe Resorptionsrate der HMO ermöglichen den intensiven Kontakt mit Epithelzellen im Dünndarm und Dickdarm.Bei den Studien zur möglichen Beeinflussung der Zellproliferation, -differenzierung und Apoptose zeigten die Oligosaccharide meist nur schwacheWirkungen auf die Biologie der Epithelzellen. Die nachgewiesenen proliferationshemmenden Effekte einiger Vertreter der HMO (negativ geladenebzw. höhermolekulare HMO) erscheinen unter physiologischen Bedingungen und im Vergleich zu anderen Nahrungsinhaltstoffen als relativunbedeutend. Ad 4) Nach Befunden aus der Literatur besitzen ausgewählte HMO antibakterielle und antivirale Eigenschaften, da sie als lösliche Liganden imRespirations-, Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt fungieren können. Trotz umfangreicher Validierung verschiedenster Modellsysteme gelang esuns nicht, die antiadhäsive Wirkungen von HMO in physiologischen Konzentrationsbereichen nachzuweisen. Reproduzierbare Befunde konntenjedoch mit dem glykosylierten Peptidbruchstück des bovinen K-Casein erhalten werden. Zusammenfassend lässt sich für die hier durchgeführtenStudien zum Schicksal der Oligosaccharide der Humanmilch im Gastrointestinaltrakt und zu ihrer biologischen Rolle feststellen: Aufgrund ihreraußerordentlichen Stabilität gegenüber intestinalen Hydrolasen und ihrer geringen Resorptionsrate im Dünndarm scheinen die Oligosaccharide inerster Linie als fermentierbare Ballaststoffe für den Säugling zu fungieren. Human milk is especially rich in complex oligosaccharides providing an extraordinary structural diversity. Neither their fate after intake by the humaninfant nor their biological functions are known. Therefore, the aim of the present study was to answer the following questions: Are the secreted pancreatic enzymes and/or the brush border bound hydrolases in the small intestine capable of hydrolysing the freeoligosaccharides of human milk ? Our in vitro as well as in vivo experiments demonstrated an exceptional enzymatic stability of the oligosaccharides against hydrolases of thegastrointestinal tract. Even fucose and sialic acid in terminal positions of the oligosaccharides were highly resistant to the enzymatic attack. Acomplete hydrolysis could only be achieved by applying intracellular or lysosomal enzymes of pancreatic tissues. However, these enzymes are notor only in trace amounts inherent in pancreatic secretions. Therefore, human milk oligosaccharides most likely survive passage along the humansmall intestine as intact molecules. As shown recently, the milk oligosaccharides are submitted to fermentation in the infants large intestinecomparable to other non starch polysaccharides. In this way these oligosaccharides may serve primarily as the soluble fiber fraction of human milk. Are oligosaccharides of human milk absorbed in their intact form or after partial digestion? Supported by the results obtained in our in vitro systems, oligosaccharides of human milk may permeate the small intestinal epithelia in intact formwith an absorption rate of 2 - 3 %. Within this range of low permeation rates smaller uncharged oligosaccharides show enhanced absorption whencompared to the negatively charged or larger saccharides. As there were no differences in the permeation rates between oligosaccharides andmannitol, the oligosaccharides most likely use the paracellular permeation route; similar to mannitol. This implies that intracellular hydrolysis inepithelia may not be of great importance. When oligosaccharides were administered to young mice, small amounts were detected in the liver aswell as in the urine, partly in intact form. However, the absorption rates in this animal model were similar to those determined in Caco-2 monolayercultures. As human milk oligosaccharides mostly escape absorption, larger amounts are submitted to the microflora of the human infant. This mightbe important for the selection of a particular colonic flora. Furthermore, the fermentation products of the oligosaccharides such as butyrate mayserve as energy fuel in colonic cells and provoke the growth of the epithelium. Do oligosaccharides of human milk affect the cell cycle of intestinal epithelial cells ? The high stability and low absorption rate of the oligosaccharides provide an intense contact with the intestinal epithelial cells. The results of ourstudies do not indicate a profound effect of milk oligosaccharides on proliferation, differentiation or apoptosis of epithelial cells. Although proliferationrates of Caco-2 and HT-29 cells were significantly reduced, especially by high concentrations of acidic or high molecular weight oligosaccharides,this was not accompanied by an increase in differentiation or induction of physiological cell death. The reduced proliferation rates seen with somehuman milk oligosaccharides seem to be of no great importance under physiological conditions and in comparison to other food ingredients. Do free or peptide bound milk oligosaccharides possess anti-adhesive properties ? According to the literature several milk oligosaccharides have anti-bacterial as well as anti-viral properties in acting as soluble receptors in therespiratory tract, the gastrointestinal as well as the urinary tract. To test this assumption for the milk oligosaccharides available to us, we developeddifferent model systems. In spite of several methods to test the adherence of bacterial strains to epithelial cells or isolated brush bordermembranes, none of the human milk oligosaccharides showed reproducible effects on adhesion. Only a cell culture model of Caco-2 cells providedconsistent results showing distinct anti-adhesive effects of the glycosylated part of bovine k-casein at higher concentrations but not of free milkoligosaccharides. These results, along with the low absorption rates, do not support an important role of human milk oligosaccharides asanti-adhesive molecules in extraintestinal tissues such as the respiratory or urogenital tract. In summary, we conclude with respect to the fate and biological role of human milk oligosaccharides, that - based on their extraordinary stabilityagainst gastrointestinal hydrolysis and their low rates of absorption in the small intestine - they seem to function primarily as the soluble fibre fractionof human milk. As there might be the possibility of further biological functions of human milk oligosaccharides in infant metabolism, they clearly needto be investigated further.