Das retinale Pigmentepithel (RPE) erfüllt einige wichtige Funktionen in der Versorgung der Photorezeptoren. Dabei besteht eine enge funktionelle Interaktion zwischen den Photorezeptoren und den Zellen des RPE. Bestrophin 1 ist das Genprodukt des BEST1-Gens, welches notwendig für die Kalciumhomöostase der RPE-Zellen ist, indem es als Chloridionenkanal das Gegenion zum Kalzium transportiert, also einen Ionenkanal darstellt. Bestrophin1 wird an der basolateralen Membran des RPE exprimiert und steht so in direktem Kontakt zu den Photorezeptoren (Johnson et al., 2017). Mutationen des BEST1-Gens führen zu verschiedenen Erkrankungen des Auges wie der juvenilen vitelliformen Makuladystrophie nach Best, der adulten vitelliformen Makuladystrophie, der autosomal dominanten Vitreochoroidopathie, der autosomal rezessiven Bestrophinopathie und der Retinitis pigmentosa (Johnson et al., 2017). Die Erkrankungen manifestieren sich durch einen reduzierten Chloridionenfluss und erzeugen reduzierte Ableitungen im EOG (Yu et al., 2007;Sun et al., 2002). Die Mutationen zeigen reduzierte Penetranz und variable Expressivität (Johnson et al., 2017) . Die häufigste Form ist der autosomal dominant vererbte M. Best. Der M. Best zeigt kein einheitliches Alter bei Beginn der Erkrankung und keinen einheitlichen zeitlichen Verlauf der Progression. Oftmals entwickeln Träger ursächlicher Mutationen (z.B. p.N99K, p.D312N oder die Deletionsmutante p.I295del) keine Symptomatik (reduzierte Penetranz). Ziel dieser Arbeit war es, den Pathomechanismus der reduzierten Penetranz für die Missense Mutationen p.N99K, p.D312N und die Deletionsmutante p.I295del zu untersuchen. Dafür wurde zunächst mittels RT-PCR die DNA des BEST1-Gens aus humaner RNA gewonnen. Das Gen wurde in den pCR®2.1TOPO®-Vektor kloniert und mit einem His-Tag versehen. Im Anschluss wurde das His-markierte BEST1-Gen in den pcDNA3.1(+)Expressionsvektor kloniert. Mittels Mutagenese-PCR wurden dann die Mutationen p.D312N, p.N99K und p.I295del eingefügt. Die Konstrukte wurden in MDCK-II-Zellen heterolog exprimiert und immunhistochemisch untersucht. Hier zeigte sich, dass das Wildtyp-Genprodukt wie erwartet, zur Plasmamembran transportiert wurde, während das Genprodukt der p.D312N-Mutation gleichmäßig im Zytoplasma verteilt vorlag, ebenso wie das Genprodukt der p.I295del-Mutation. Das Genprodukt der p.N99K-Mutation lag ebenfalls zytoplasmatisch vor, jedoch in granulären Strukturen. Für die Untersuchung der Interaktion der mutierten Genprodukte mit dem Wildtyp wurde eine MDCK-II-Zelllinie generiert, die ein Myc-Tag markiertes Wildtyp-Bestrophin 1 stabil exprimierte. Diese Zelllinie wurde mit dem His-Tag-markierten hBEST1, das die Mutationen p.D312N, p.N99K und p.I295del trug, transfiziert und die heterologe Expression mit Hilfe der SDS-PAGE im Western Blot mit Myc-und His-Tag-spezifischen Antikörpern dargestellt. Der Proteinnachweis mit dem Myc-Tag spezifischen Antikörper zeigte deutlich geringere Mengen Genprodukt bei Expression der Mutationen p.D312N-His und den Mutationen p.N99K und p.I295del im Vergleich zum Wildtyp-Genprodukt. Mit dem His-Tag-spezifischen Antikörper wurde die Interaktion näher untersucht. Es konnte eine unwesentlich stärkere Expression des Wildtyp-Genprodukts im Vergleich zu den Mutationen nachgewiesen werden. In einer Immunpräzipitation über den His-Tag konnte Myc-Tag-markiertes Wildtyp-Genprodukt mit dem Wildtyp-Genprodukt präzipitiert werden. Mit dem p.D312N-His-Genprodukt konnte Myc-Tag-markiertes Wildtyp-Bestrophin 1 in vergleichbarer Menge isoliert werden. Über die Genprodukte p.N99K-His und p.I295del-His waren kaum nachweisbare Mengen Myc-Tag-markiertes Wildtyp-Bestrophin 1 zu isolieren. Die Gegenprobe mit dem His-Tag spezifischen Antikörper zeigte erneut eine vergleichbare Menge des Wildtyp-Genproduktes und des p.D312N-Genproduktes, wohingegen die Signale der Mutationen p.N99K und p.I2915del schwächer waren. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Studie durchgeführt. Auch hier konnte eine Kolokalisation der beiden Wildtypproteine nachgewiesen werden. Allerdings war die Lokalisation der Wildtyp-Genprodukte zytoplasmatisch und nukleär und damit nicht physiologisch, da die Zellen die Epithelialisierung noch nicht abgeschlossen hatten. Die Genprodukte der Mutation p.D312N-His lagen um den Zellkern herum und zytoplasmatisch vor. Die Mutation p.N99K lag zytoplasmatisch in granulären Strukturen vor, wurde aber nicht zur Plasmamembran transportiert. Das Wildtypprotein lag vor Allem nukleär vor. Bei der Mutation p.I295del war die Expression des Wildtyp-Bestrophin 1 stark reduziert und das Protein war zytoplasmatisch lokalisiert, während das mutierte Protein stark überexprimiert war und zytoplasmatisch vorlag. Diese Ergebnisse können eine Erklärung für die reduzierte Penetranz, die die Mutationen p.N99K und p.I295del zeigen, darstellen. Ausserdem lassen sie den Schluss zu, dass die Patienten aufgrund von Haploinsuffizienz erkranken.
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