Alpha-Hämolysin (alphaHly) ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor des gramnegativen Bakteriums Escherichia coli. AlphaHly wird meist von uropathogenen E. coli Stämmen produziert und kann neben einer direkten Zelllyse auch eine Reihe von sekundären Zellreaktionen auslösen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Porenbildung durch alphaHly elektro- physiologisch an humanen embryonalen Nierenzellen charakterisiert. Für die halbmaximale Porenbildung durch alphaHly wurde ein EC50-Wert von 47 ng/ml ermittelt, was der sehr niedrigen Konzentration von 427 pM entspricht. Der Hill-Koeffizient aus der Konzentrations-Wirkungsbeziehung betrug 1,8, was dafür spricht, dass mindestens zwei alphaHly-Moleküle an der Bildung einer funktionellen Pore beteiligt sind. Es zeigte sich, dass die alphaHly-Poren ausschließlich schnelle Öffnungen und Schlüsse aufweisen, womit sich ihre Porenkinetik von anderen in unserer Arbeitsgruppe bereits charakterisierten Toxinen, wie Listeriolysin und Pneumolysin, deutlich unterscheidet. Die Amplitudenverteilung der alphaHly-Porenströme ergab ein einzelnes Maximum mit einem Wert von 18,5 pA bei einem Membranpotential von -40 mV, womit sich für die einzelne alphaHly-Pore eine Porenleitfähigkeit von 463 pS errechnet.
Mit Hilfe der Punktmutanten deltaB und deltaAB konnte eine für die Porenbildung essentielle Aminosäure an Position 690 des alphaHly-Moleküls identifiziert werden. Es bleibt aber noch unklar, ob die Aminosäure Lysin selbst oder ihre Fettsäuren-Acylierung, im Sinne einer posttranslationalen Modifikation, essentiell für die Porenbildung ist. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass ein Mix aus Toxinmutante deltaB bzw. deltaAB und Wildtyp-Toxin im Vergleich zum Wildtyp-Toxin alleine zu einer signifikant verminderten Porenbildung führte. Dies spricht ebenso, wie der ermittelte Hill-Koeffizient, für eine Beteiligung von mehreren alphaHly-Molekülen an der Bildung einer funktionellen Pore.
Es konnte nachgewiesen werden, dass die Porenbildung durch alphaHly reversibel ist. Die Hemmung der zytoskelettalen Komponenten Aktin und Tubulin führt zu einer signifikant erhöhten Zahl offener Poren/min. Dies könnte dafür sprechen, dass am Verschluss offener alphaHly-Poren aktin- bzw. tubulin-abhängige endozytotische Prozesse beteiligt sind. Auf eine Beteiligung von Tyrosinkinasen und MAP-Kinasen an der Porenbildung durch alphaHly ergaben sich in den durchgeführten Experimenten hingegen keine Hinweise.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Substanzen auf eine mögliche Blockade offener alphaHly-Poren untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Farbstoff Eosin Y, der offene Listeriolysin-Poren blockiert, keinen Einfluss auf alphaHly-Poren hat. Auch die Farbstoffe Brilliantgrün, Fuchsin, Säurefuchsin, Gentianaviolett und Methylenblau, sowie die Calciumkanalblocker Nifedipin und Nicardipin, hatten keinen Einfluss auf die alphaHly-Poren. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Lanthanoide Gadolinium, Lanthan und Ytterbium alphaHly-Poren blockieren können, wobei die EC50-Werte für die halbmaximale Blockade des Porenstroms, im niedrigen mikromolaren Bereich lagen und Gadolinium die höchste Potenz zeigte. Patienten mit uropathogenen E.coli-Infektionen könnten in Zukunft von diesen Porenblockern profitieren. Auf der Basis unserer Daten müssen sich nun weitere Versuche, wie die Untersuchung von Lanthanoiden im Sepsis-Modell der Maus, anschließen.
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