Vergleich von quantitativer und digitaler Polymerasekettenreaktion in der Diagnostik von Humanen Papillomavirus-getriebenen Oropharynxkarzinomen

Das Humane Papillomavirus (HPV) - getriebene Oropharynxkarzinom (OPSCC) verzeichnete zuletzt im globalen Norden eine steigende Inzidenz. Zur verbesserten Diagnostik von HPV-positiven OPSCC wurde in dieser Arbeit der Einsatz der minimal-invasiven Liquid Biopsy zum Nachweis der viralen Onkogene E6 und E7 als Biomarker in Plasmaproben untersucht. Für die Untersuchung von HPV-DNA wurden sowohl die quantitative als auch die digitale PCR angewandt und hinsichtlich ihrer analytischen und diagnostischen Leistung miteinander verglichen.
Im Rahmen der Methodenetablierung eines Triplex Assays zum simultanen Nachweis von E6, E7 zusammen mit einem humanen Referenzgen für qPCR und dPCR wurde die analytische Leistungsfähigkeit evaluiert. Mit dem synthetisierten Kontrollplasmid als Substrat konnte für beide PCR-Methoden eine hohe Linearität (R2 ≥ 0,99) innerhalb des dynamischen Messbereiches (qPCR: 7 Log10 bzw. dPCR: 5 Log10 Konzentrationsstufen) erreicht werden. Zur Assay-Optimierung erfolgte eine Plasmidrestriktion, die zu einer geringeren Inter-Assay-Variabilität der qPCR sowie einer verbesserten Signalauftrennung der dPCR führte.
Die diagnostische Validität des entwickelten Triplex Assays wurde bei der Messung von Liquid Biopsy Proben von Patienten mit HPV-positiven (n = 17) und HPV-negativen (n = 14) OPSCC geprüft. Sowohl mittels qPCR als auch dPCR konnte für den Nachweis von HPV-DNA im Plasma eine gute Sensitivität von 82,4%, sowie eine Spezifität von 82,2% in der qPCR und 89,3% in der dPCR erreicht werden. Bei der Betrachtung der viralen Kopien E6 und E7 in Abhängigkeit des TNM-Status wurde eine signifikant höhere Zahl an HPV-DNA bei fortgeschrittenen Lymphknotenbefall (N2-N3) nachgewiesen. Die Analyse des Zusammenhangs sowie der Übereinstimmung beider Methoden für die Quantifizierung von HPV-DNA zeigte eine hohe lineare Korrelation sowie eine relative Unterschätzung der Kopienzahl mittels dPCR bzw. eine Überschätzung mittels qPCR.
Insgesamt zeichnen sich die viralen Onkogene E6 und E7 als stabile Biomarker beim HPV-getriebenen OPSCC aus. Sowohl für qPCR als auch dPCR konnte der Nutzen in der Tumordiagnostik und perspektivisch auch in der Tumornachsorge verdeutlicht werden. Aufgrund der kalibrierungsfreien Messung kann die dPCR zur Standardisierung und höheren Präzision bei der Quantifizierung von zellfreier Tumor-DNA beitragen. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse dieser Arbeit sind für die zukünftige Anwendung der dPCR bei Liquid Biopsy Proben in der klinischen Routine weitere Studien nötig, um einheitliche Arbeitsabläufe festzulegen und diagnostische Grenzwerte zu bestimmen.