Die native Oxygenase aus Pleurotus sapidus, welche die selektive allylische Oxidation von (+)-Valencen zu (+)-Nootkaton katalysiert, wurde proteinbiochemisch charakterisiert. Das Enzym liegt intrazellulär vor und weist ein Molekulargewicht von 76 kDa und einen pI von 5,81 auf. Die Oxygenase wurde hinsichtlich der Stabilität in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer und verschiedenen Zellaufschlusstechniken untersucht. Die höchste Produktkonzentration an (+)-Nootkaton wurde durch den Aufschluss mittels Rührwerkskugelmühle erzielt. Sowohl die Transformationsaktivität als auch das Proteinbandenmuster des PSA-Myzels wurden mit der Aktivität und dem Bandenmuster des Fruchtkörpers verglichen. Des Weiteren wurden die Aktivitäten der Enzyme aus Pleurotus sapidus, Pleurotus ostreatus und Pleurotus eryngii gegenüber (+)-Valencen und deren Proteinbandenmuster untersucht und verglichen. Die cDNA der Oxygenase aus Pleurotus sapidus wurde in Vorarbeiten isoliert und von ARTES Biotechnology GmbH heterolog in Hansenula polymorpha exprimiert. Die kodierende Gesamtsequenz des Enzyms wurde dabei jedoch nicht vollständig isoliert. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit die cDNA-Sequenz der Oxygenase erneut isoliert und das Enzym heterolog exprimiert. Die höchsten Homologien auf Basis der Aminosäuresequenz wurden zu einer postulierten Lipoxygenase aus Pleurotus ostreatus nachgewiesen. Bei der heterologen Expression durch ARTES Biotechnology GmbH wurde lösliches aber inaktives Enzym erhalten. Deswegen wurde die rekombinante Oxygenase mittels iFOLD® Protein Refolding System-Kit rückgefaltet; trotz Proteinrückfaltung wurde kein aktives Enzym erhalten. Mittels Real-time-PCR wurde die Untersuchung der Expression der Oxygenase in den Seitlingen Pleurotus sapidus, Pleurotus ostreatus und Pleurotus eryngii vorgenommen. Als Proben-Templates wurden die cDNA-Erststränge (ss) von P. sapidus, P. eryngii und P. ostreatus der unterschiedlichen Kulturtage eingesetzt. Die Anzahl der Transkripte der Oxygenase in dem Basidiomyceten Pleurotus sapidus betrug von 25 bis 71 Kopien ng^&
#8722;1 cDNA(ss). Die Anzahl in Pleurotus eryngii und Pleurotus ostreatus lag wesentlich niedriger. Die rekombinante Peroxidase MsP1 aus Mycetinis scorodonius wurde bei der Firma DSM in Aspergillus niger erfolgreich überexprimiert und ist die erste heterolog exprimierte DyP-Typ-Peroxidase aus der Familie der Schwindlingsverwandten. Um MsP1 von dem Kulturüberstand abzutrennen, wurde eine geeignete Reinigungsmethode mittels FLPC entwickelt. Die gereinigte DyP-Typ-Peroxidase wurde proteinbiochemisch charakterisiert und deren kinetische Parameter für unterschiedlichste Substrate bestimmt. Das aktive Enzym liegt im Gegensatz zu anderen DyP-Typ-Peroxidasen als Dimer vor. MsP1 weist eine hohe Thermostabilität auf. Das pH-Profil des Enzyms zeigte, abhängig von den eingesetzten Substraten, Aktivitätsmaxima zwischen pH 2,5 und 4,5. Neben dem Einfluss von Wasserstoffperoxid wurde auch der Einfluss von Sauerstoff auf die Enzymaktivität von MsP1 untersucht. MsP1 oxidiert ß-Carotin auch in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid, wobei die Enzymaktivität durch die Zugabe von H2O2 signifikant gesteigert werden kann. Des Weiteren wurde die Enzymaktivität gegenüber ß-Carotin durch die Anreicherung des Reaktionspuffers mit Sauerstoff um den Faktor 2,3 gesteigert. Dies deutet darauf hin, dass MsP1 neben der Peroxidase- auch eine Oxidasefunktion aufweist. Das ermittelte Substratspektrum des Enzyms umfasste neben natürlichen Farbstoffen und dem charakteristischen DyP-Typ-Substrat auch bekannte Substrate für polyvalente Peroxidasen und Mangan- bzw. Ligninperoxidasen. Die Fähigkeit von MsP1, Mn2+ zu oxidieren, ist außergewöhnlich und wurde bisher nur für eine weitere DyP-Typ-Peroxidase aus Pilzen beschrieben. Zur Rückgewinnung von MsP1 aus technischen Prozessen wurde reines MsP1 mit Hilfe kovalenter chemischer Bindungen an Oberflächen von Silica-Monolithen und Polystyrolkugeln immobilisiert. Zum einen erfolgte die Immobilisierung mit Glutardialdehyd; zum anderen durch eine chemische Aktivierung der Oberflächengruppen mit N-(3-Dimethylaminopropyl)-N -ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS). Mit Hilfe von Glutardialdehyd wurden zwar geringe Mengen des gereinigten MsP1 an die verwendeten Silica-Monolithen immobilisiert; jedoch führte die anschließende Reduktion der Schiffschen Base mittels Natriumborhydrid zu einer Inaktivierung des Enzyms. Mit Hilfe von EDC und NHS wurde aktives MsP1 erfolgreich an Silica-Monolithen und Polystyrol-Kugeln immobilisiert. Von diesen Materialien wurde die Wiederverwendbarkeit sowie die Lagerstabilität überprüft. Weiterhin wurden sie zur Bleichung von Molke eingesetzt. Immobilisiertes MsP1 bleichte sowohl den durch Annattozusatz gefärbten Natriumacetat-Puffer, als auch die gefärbte Molke innerhalb von 12 Stunden. Das Resultat der Bleichung war vergleichbar mit dem Resultat der Bleichung durch nicht immobilisiertes, aktives Enzym.
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