Herstellung einer VEGF depletierten RPE Zelllinie zur Etablierung eines VEGF Biosensorsystems für die nicht-invasive Messung im Auge

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2020

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-14891

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Bei neovaskulären Krankheiten wie der altersassoziierten Makuladegeneration oder der diabetischen Retinopathie kommt es zu einer Überproduktion von VEGF im Bereich der Netzhaut. Durch Gefäßneubildungen oder erhöhte Exsudation kommt es zu Ablösungen der Netzhaut und zu massiven Einschränkungen des Sehvermögens. Die bisherige Therapie besteht unter anderem aus klonalen VEGF-Antikörpern, welche subretinal injiziert werden. Eine Messung der direkten Auswirkung und eine personalisierte Anpassung der Therapie ist dabei nicht möglich. Um einen neuen Biosensor zur VEGF-Messung im Auge nutzen zu können, war das Ziel der Arbeit daher eine Zelllinie zu etablieren, die kein eigenes VEGF produziert.Der Gen-Knockout des VEGF ist mithilfe des CRISPR-Cas9 Systems erfolgt. Dazu wurden mehrere guideRNAs erstellt, welche die Cas9 Endonuklease spezifisch zur richtigen Basensequenz im Genom führen soll. Nach Klonierung der Guides in ein Plasmid, welches für Cas9 codiert, und Kontrolle der Ausführung, zeigten drei Guides eine gute Aktivität im Test mit dem NHEJ-Sensor. Nach Optimierung der Transfektions- und Selektionsbedingungen für die ausgewählten ARPE-19 Zellen wurde die Transfektion mit diesen drei Guides in verschiedenen Kombinationen durchgeführt.Durch die Separation einzelner Zellklone wurden verschiedene Zelllinien etabliert, welche anschließend auf den erfolgreichen Gen-Knockout auf Proteinlevel kontrolliert wurden. Der dafür verwendete Sandwich-ELISA zeigte drei Zelllinien auf, bei denen das VEGF unter der Nachweisgrenze lag. Im Proliferationsassay zeigte sich keine Verminderung der Zellteilung im Vergleich mit den Wildtyp ARPE-19 Zellen.In folgenden Schritten gilt es nun den VEGF-Biosensor auf der Zellmembran dieser Zellen zu verankern und die Zellen im Bereich der Augenhintergrundes immobilisiert dauerhaft zu kultivieren. Dann kann durch die Zugabe des Luciferasesubstrats jederzeit die aktuelle VEGF-Konzentration gemessen werden und die Therapie entsprechend angepasst werden.

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