Untersuchungen zur Rolle des Transkriptionsfaktors NF-IL6 in der Hypothalamus-Hypophysen-Achse bei Ratten und Mäusen nach psychologischem und inflammatorischem Stress

Abstract

Hintergrund und Zielsetzung der ArbeitMit der systemischen Injektion von Lipopolysaccharid [LPS, Zellwandbestandteil gram-negativer Bakterien und Mitglied der sog. PAMPS (Pathogen-assoziierte Molekülstrukturen)] kann bei Versuchstieren eine Entzündung nachgeahmt werden, die zentralnervös kontrollierte Krankheitssymptome wie Fieber und andere zum Komplex des sog. sickness behavior gehörende Erscheinungen (Anorexie, Adipsie und Lethargie) zur Folge hat. Der gesamte Organismus reagiert mit der sog. Akute-Phase-Reaktion (APR), um pathogene Fremdmoleküle zu bekämpfen und die ursprüngliche Homöostase wiederherzustellen. Dabei agiert das Immunsystem nicht alleine, sondern als ein Bestandteil einer Gesamtheit, die das Überleben des Organismus gewährleistet. Das Immunsystem, das zentrale Nervensystem (ZNS) und das endokrine System ermöglichen über spezielle Botenstoffe die notwendige Kommunikation zwischen Peripherie und ZNS. Anhand der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren [z. B. NFκB ( nuclear factor kappaB ), STAT3 ( signal transducer and activator of transcription 3 ), NF-IL6 ( nuclear factor for IL-6 )] lässt sich die genomische Aktivierung von Zellen innerhalb des ZNS nachweisen. Dies kann als eine Art Endpunkt der Signalübermittlung von peripheren Immunsignalen an entsprechende regulatorische Zentren des ZNS angesehen werden. Im Zuge der APR kommt es auch zur Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA-Achse), die sich aus dem hypothalamischen CRH (Corticotropin-Releasing Hormon), dem hypophysären ACTH (Adrenocorticotropes Hormon) und dem Corticosteron bzw. Cortisol aus der Nebennierenrinde zusammensetzt und einer überschießenden proinflammatorischen Antwort des Immunsystems entgegenwirken soll. Der Transkriptionsfaktor NF-IL6, welcher zur Familie der CCAAT/Enhancer-bindenden Proteine gehört, ist im Gehirn in zahlreichen Zelltypen ein Aktivitätsmarker für längerfristige Entzündungsreaktionen und seine de novo-Synthese sowie Aktivierung wird unter anderem durch IL-6 (Interleukin-6), aber auch TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) und womöglich IL-10 (Interleukin-10) initiiert. Dadurch erfolgt eine gesteigerte Expression seiner Zielgene, zu denen COX-2 (Cyclooxygenase-2), mPGES (mikrosomale Prostaglandin-E-Synthase), TNF-α und IL-10, aber auch CRH und POMC (Proopiomelanocortin) gezählt werden.In der vorliegenden Arbeit wurde die potenzielle Rolle von NF-IL6 sowohl in der LPS-induzierten als auch in der stressinduzierten HPA-Achse im Zusammenhang mit der Entstehung von Fieber und dem sog. sickness behavior analysiert. Um einen weiteren Beitrag zur Bedeutung und Funktion von NF-IL6 als späten Zellaktivierungsmarker bei systemischen Entzündungen leisten zu können, erfolgte zusätzlich eine Untersuchung von mehreren physiologischen Parametern (Körperkerntemperatur, lokomotorische Aktivität, Futter- und Trinkwasseraufnahme, Entwicklung des Körpergewichts) bei NF-IL6-defizienten Mäusen.MethodikDie Gehirne der mit verschiedenen LPS-Dosen injizierten oder durch ein Open Field Stress Versuch stimulierten Ratten bzw. NF-IL6-Knock-out-Mäuse wurden vorwiegend für immunhistochemische, aber auch zum Teil für molekularbiologische Untersuchungen verwendet. Des Weiteren wurden bei den Ratten im Open Field Stress Versuch und bei den NF-IL6-defizienten Mäusen sowohl nach Open Field Stress Versuch als auch nach LPS-Injektion die physiologischen Parameter (Körperkerntemperatur, lokomotorische Aktivität, Futter- und Trinkwasseraufnahme) telemetrisch erfasst und ausgewertet. Plasmazytokine (TNF-α und IL-6) der Versuchstiere wurden mittels Bioassay analysiert. Darüber hinaus erfolgte die Untersuchung von NF-IL6 im LPS-induzierten Zytokinmilieu einer primären Zellkultur des Hypophysenvorderlappens (HVL) von Ratten mittels verschiedener Zytokinantikörper und dem JAK-STAT-Inhibitor AG490.KernbefundeDie Rolle von NF-IL6 in der humoralen Signalweiterleitung an das ZNSZum ersten Mal konnte eine NF-IL6-Aktivierung 8 h nach einer LPS-Injektion (100 µg/kg KGW) im Bereich der Circumventrikulären Organe [OVLT (Organum vasculosum laminae terminalis), SFO (Organum subfornicale), ME (Eminentia mediana)], in Zellen des SON (Nucleus supraopticus), in Gehirnendothelzellen und im Plexus choroideus der Maus beobachtet werden. NF-IL6 scheint demzufolge speziesübergreifend (zusätzlich zur Ratte auch in der Maus) an der LPS-induzierten humoralen Signalweiterleitung beteiligt zu sein. NF-IL6 in der LPS-induzierten Hypothalamus-Hypophysen-AchseBei Ratten konnten NF-IL6-Signale in der LPS-induzierten (100 µg/kg KGW) Hypothalamus-Hypophysen-Achse sowohl auf der Ebene des Hypothalamus (PVN) als auch auf der Ebene der Hypophyse detektiert werden. Der zeitliche Höhepunkt der Immunreaktivität von NF-IL6 lag bei 8 h post injectionem (p.i.). Im Rahmen dieser Arbeit konnten in der Hypophyse corticotrope Zellen, Endothelzellen, perivaskuläre Makrophagen, Pituizyten und Neuronenausläufer aus dem PVN als NF-IL6-positiv detektiert werden. Darüber hinaus waren zum Zeitpunkt 8 h p.i. im HVL die Transkriptionsfaktoren NF-IL6, NFκB sowie STAT3 zum einen als singuläres Signal und zum anderen in Colokalisation (NF-IL6-NFκB und NF-IL6-STAT3) anzutreffen. Entsprechend der vorliegenden Daten scheint NF-IL6 sowohl an der LPS-induzierten Weiterleitung peripherer Immunstimuli als auch an der LPS-induzierten Aktivierung der HPA-Achse und möglicherweise an der Synthese von ACTH beteiligt zu sein. Die Colokalisation aktivierter einzelner Transkriptionsfaktoren dürfte ein synergistisches bzw. antagonistisches Zusammenspiel ( cross talk ) ermöglichen und damit die Expression bestimmter Zielgene (z. B. IL-6 oder POMC) in der Hypophyse beeinflussen. NF-IL6 in der stressinduzierten Hypothalamus-Hypophysen-AchseEin psychologischer Stressstimulus (Open Field Stress) bei Ratten führte nicht nur zu einer signifikanten Erhöhung der Körperkerntemperatur und einem signifikanten Anstieg der IL-6-Konzentrationen im Blut der Versuchstiere, sondern resultierte ähnlich dem infektiösen Stimulus (LPS-Injektion) in einer NF-IL6-Aktivierung im Hypothalamus (PVN) und in der Hypophyse mit einem zeitlichen Höhepunkt bei 90 Minuten nach Stressbeginn. Im Gegensatz zur LPS-induzierten Aktivierung zeigten jedoch die Endothelzellen des PVN keine NF-IL6-Signale. In der Hypophyse nahmen die perivaskulären Makrophagen eine Sonderstellung ein, da sie als einziger identifizierter Zellphänotyp ein positives NF-IL6-Signal zeigten. Somit scheint NF-IL6 zwar an der Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Achse, aber nicht an der durch einen Open Field Stress aktivierten Synthese von ACTH in corticotropen Zellen direkt beteiligt zu sein. In weiteren Open Field Stress Versuchen konnte außerdem gezeigt werden, dass NF-IL6-defiziente Mäuse im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren eine verringerte, stressinduzierte Erhöhung der Körperkerntemperatur aufwiesen. Dies belegt zum ersten Mal, dass NF-IL6 tatsächlich auch an psychologischen, stressinduzierten Reaktionen und damit wahrscheinlich an der Hypothalamus-Hypophysen-Achsen-Aktivierung beteiligt zu sein scheint. Eine solche, wahrscheinlich indirekte, Beteiligung von NF-IL6 wäre beispielsweise auch über PACAP ( pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide ) denkbar, bleibt aber in weiterführenden Studien noch zu untersuchen. NF-IL6 in follikulostellaten und corticotropen Zellen einer primären Zellkultur des HypophysenvorderlappensNach Stimulation der Zellen der primären Zellkultur mit LPS bzw. mit Interleukin-1β (IL-1β) konnten erhöhte Konzentration an IL-6 und TNF-α im Überstand gemessen werden, die durch die Anwendung verschiedener Antikörper (IL-6-, IL-10- und TNF-α-Antikörper) beeinflusst wurden. Dadurch konnte das Zusammenspiel der einzelnen Zytokine im Milieu des HVL und im Zusammenhang mit NF-IL6 näher untersucht werden, da Zytokine einen wesentlichen Beitrag zur adäquaten Reaktion der Hypophyse auf infektiöse oder stressinduzierte Stimuli leisten. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass NF-IL6 möglicherweise in der LPS-induzierten Synthese von TNF-α durch follikulostellate Zellen, die auch IL-6 synthetisieren, eine wichtige Rolle spielt. Die LPS-induzierte NF-IL6-Immunreaktivität colokalisierte mit induzierter TNF-α-Immunreaktivität sowie erhöhten TNF-α-Konzentrationen in den Zellkulturüberständen. Des Weiteren wurden Hinweise dafür gefunden, dass IL-6 womöglich an der NF-IL6-vermittelten und verstärkten Expression des POMC-Gens in corticotropen Zellen und somit auch NF-IL6 an der erhöhten ACTH-Synthese nach LPS-Stimulation beteiligt ist. Die LPS-induzierte Immunreaktivität von ACTH in corticotropen Zellen wurde durch IL-6-Antikörper gehemmt und durch IL-10-Antikörper gefördert. IL-10, als antiinflammatorisches Zytokin, führte demnach über einen negativen Feedbackmechanismus zu einer Inhibition sowohl der Synthese verschiedener Zytokine (IL-6) als auch der LPS-induzierten ACTH-Produktion in der Hypophyse. Die Anwendung des JAK-STAT-Inhibitors AG490 hemmte anteilig die LPS-induzierte NF-IL6-Expression und führte in diesem Zusammenhang nicht nur zu einer deutlichen Reduktion der TNF-α-Synthese, sondern auch zu einer Erniedrigung der Anzahl der ACTH-positiven Zellen im HVL. Dies deutet darauf hin, dass der JAK-STAT-Signalweg an diesen Prozessen (ACTH- und TNF-α-Synthese) beteiligt ist.NF-IL6-Knock-out-MäuseDie verwendeten NF-IL6-Knock-out-Mäuse zeigten als Nebenbefund eine übersteigerte Immunreaktion auf Fremdkörper und Veränderungen im Bereich der Kornea.Die Auswirkungen der NF-IL6-Defizienz auf die Thermoregulation äußerten sich nach der Injektion einer niedrigen LPS-Dosis (50 µg/kg KGW) in einer ähnlichen Fieberreaktion wie in Wildtyp-Tieren. Das Fieber stieg allerdings gegen Ende des Versuchszeitraumes (24 h) nur in den genetisch veränderten Tieren erneut signifikant an. Dies spricht für eine Bedeutung von NF-IL6 für die Beendigung einer Fieberreaktion. Des Weiteren entwickelte sich nach der Injektion einer hohen LPS-Dosis (2,5 mg/kg KGW) lediglich zwischen 23-24 Stunden ein kurzer signifikanter Fieberanstieg. Wildtyp-Tiere zeigten, neben einem völligen Verlust des Tag-Nacht-Rhythmus, über den gesamten Zeitraum von 24 Stunden eine signifikant erhöhte bzw. veränderte Körperkerntemperatur. Die Reaktion der Wildtyp-Mäuse war nach beiden LPS-Dosen von Anorexie und Adipsie begleitet, während NF-IL6-defiziente Tiere lediglich nach der hohen Dosis die oben genannten Symptome zeigten. Das heißt, dass die Bedeutung von NF-IL6 für die Fieberentstehung, aber auch für Symptome des sickness behaviors (Anorexie, Adipsie) abhängig von der Dosis des inflammatorischen Stimulus LPS ist. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal beobachtet werden, dass NF-IL6-Knock-out-Mäuse eine deutlich reduzierte motorische Aktivität im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren zeigten, sowohl nach LPS-Injektion als auch nach einem Open Field Stress, was womöglich mit Veränderungen in der Expression von IL-10 sowie Dopamin im Gehirn zusammenhängen könnte.SchlussfolgerungenDie vorliegende Arbeit zeigt zum einen die Vielschichtigkeit der Funktionen des Transkriptionsfaktors NF-IL6 und zum anderen die Komplexität der durch einen peripheren Immunstimulus (LPS) bzw. durch einen Stressstimulus (Open Field Stress) angestoßenen Kommunikationswege zwischen Immunsystem, zentralem Nervensystem und endokrinem System. Die potenzielle Rolle in der Aktivierung der HPA-Achse sowie bei der Entstehung von Fieber und zentralnervös kontrollierten Krankheitssymptomen, macht diesen Transkriptionsfaktor bei zukünftigen Untersuchungen langfristiger und vor allem anti-inflammatorischer Effekte zu einem wichtigen Untersuchungsgegenstand der (Psycho-) Neuroimmunologie. Da ein gestörtes Gleichgewicht zwischen der neuroendokrinen, hormonellen und immunologischen Kommunikation erhebliche Auswirkungen auf eine adäquate Reaktion des Immunsystems bei Infektionen und Entzündungen haben kann, stellt das diffizile Zusammenspiel von NF-IL6 und inflammatorischen Mediatoren einen wichtigen Anhaltspunkt für weitere Studien dar. Darüber hinaus besitzen zukünftige Untersuchungen ein großes Potenzial für die Entwicklung neuer Lösungsansätze im Hinblick auf therapeutische Möglichkeiten bei Krankheiten (z.B. Depressionen, rheumatische Erkrankungen sowie Krebs), deren wachsende Bedeutung auch in Zukunft die Bearbeitung weiterer Fragestellungen im Zusammenhang mit NF-IL6 erfordern werden. Background and purposeSystemic injection of the bacterial mimetic lipopolysaccharide [LPS, cell wall component of gram-negative bacteria and a member of the so-called pathogen associated molecular pattern (PAMPS)] induces inflammation in experimental animals, which is accompanied by brain controlled symptoms such as fever, anorexia, lethargy and adipsia, all of which are also termed sickness behavior . This so-called acute-phase-response (APR) helps the organism to eliminate pathogens and to restore the primary homeostasis. The immune system does not act as an individual, but as a part of an entity that ensures survival of the organism. The immune system, the central nervous system (CNS) and the endocrine system enable the necessary communication between the peripheral and the central nervous system. Genomic activation of cells within the CNS can be monitored by immunohistochemical detection of activated transcription factors [for example NFκB (nuclear factor kappaB), STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), NF-IL6 (nuclear factor for IL-6)] and is regarded as a kind of "end point" of the transmission of signals from the periphery to the regulatory centers in the CNS. In the course of the APR the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA axis) is activated, which consists of the hypothalamic CRH (corticotropin-releasing hormone) that induces the release of pituitary ACTH (adrenocorticotropic hormone) and subsequently the release of corticosterone or cortisol from the adrenal cortex to counteract an excessive proinflammatory response of the immune system. The transcription factor NF-IL6, which belongs to the family of the CCAAT/enhancer-binding proteins, is a marker for inflammatory reactions at late or chronic stages in many cell types of the brain. Its de novo-synthesis and activation is primarily induced by IL-6 (Interleukin-6), but also by TNF-α (tumor necrosis factor α) and possibly by IL-10 (Interleukin-10) and results in an increased expression of several target genes, including COX-2 (cyclooxygenase-2), mPGES (microsomal prostaglandin E synthase), TNF-α and IL-10, but also CRH and POMC (proopiomelanocortin).The potential role of NF-IL6 in LPS-induced as well as in stress-induced HPA axis activation was analyzed in the present study in the context of the development of fever and of so-called "sickness behavior". To further investigate the potential contribution and function of NF-IL6 as a late cell activation marker of systemic inflammation, several physiological parameters (core body temperature, locomotor activity, food and water intake, change in body weight) were analyzed in NF-IL6-deficient mice.Experimental ApproachRats and NF-IL-6-knock-out-mice were treated systemically with different doses of LPS or stimulated by an open field stress test and brains were analyzed using immunohistochemistry and RT-PCR. Moreover, physiological parameters (core body temperature, locomotor activity, food and water intake) were recorded by a telemetric system of rats stimulated in the open field stress test, and of NF-IL6-deficient mice, which were similarly stressed or treated with LPS. Plasma cytokines (TNFα and IL-6) of animals were analyzed by a bioassay. In addition, the role of NF-IL6 in the LPS-induced cytokine milieu of a primary cell culture of the anterior pituitary of rats was investigated using various cytokine antibodies and the JAK-STAT inhibitor AG490.Key Results The role of NF-IL6 in the humoral signaling pathway to the central nervous systemFor the first time an activation of NF-IL6 was observed 8 hours after LPS-injection (100 µg/kg) in the circumventricular organs [OVLT (Organum vasculosum laminae terminalis), SFO (Organum subfornicale), ME (Eminentia mediana)], in cells of the SON (Nucleus supraoptics), in endothelial cells of the brain and in the choroid plexus of the mouse. Thus, NF-IL6 seems to be involved in LPS-induced humoral signaling of both species, as previously shown in the rat but also in mice. NF-IL6 in the LPS-induced hypothalamic-pituitary axisIn the LPS-induced (100 µg/kg) systemic inflammation NF-IL6 signals were detected at the level of the hypothalamus (PVN) as well as at the level of the pituitary gland of the activated hypothalamic-pituitary axis in the rat. The peak of NF-IL6-immunoreactivity was 8 hours after injection. In the pituitary, corticotropic cells, endothelial cells, perivascular macrophages, pituicytes and axons of neurons projecting from the PVN to the pituitary showed positive immunoreactivity for NF-IL6. Moreover, in addition to NF-IL6 other activated (nuclear translocated) transcription factors such as STAT3 and NFκB were detected as singular signals and in colocalization (NF-IL6-NFκB and NF-IL6-STAT3) in the anterior lobe of the pituitary. According to the present data, NF-IL6 might play a key role in the transmission of peripheral immune stimuli to the brain, in LPS-induced activation of the hypothalamic-pituitary axis and in the synthesis of ACTH. The colocalization of activated transcription factors should allow their synergistic or antagonistic interaction ("cross talk") and, thus, influence the expression of specific target genes (for example IL-6 or POMC) in the pituitary. NF-IL6 in the stress-induced hypothalamic-pituitary axisA psychological stress stimulus (open field stress) in rats did not only induce a significant increase in core body temperature and a significant increase of plasma IL-6-levels but also resulted in NF-IL6-activation in the hypothalamus (PVN) and in the pituitary gland (temporal peak: 90 min) in a pattern and intensity similar to that seen after the infectious stimulus (LPS injection). In contrast to the LPS-induced activation of the HPA axis, endothelial cells of the PVN and pituitary did not show a positive NF-IL6-immunoreactivity while perivascular macrophages were the only identified cell phenotype in the pituitary, which were positive for NF-IL6. Thus, NF-IL6 seems to be involved in HPA axis activation by an open field stress, but does not directly contribute to the expression of ACTH in corticotropic cells. It was demonstrated in further open field stress experiments that NF-IL6-deficient mice show a reduced stress-induced increase in core body temperature compared to wild-type animals. This demonstrates for the first time that NF-IL6 seems to participate in psychological stress-induced reactions and, therefore, is likely to be involved in the activation of the hypothalamic-pituitary axis. Such a probably indirect involvement of NF-IL6 in this process could be mediated through PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide) but remains to be explored in further studies. NF-IL6 in folliculostellate and corticotropic cells in a primary cell culture of the anterior pituitaryLPS- or Interleukin-1β- (IL-1β) stimulation induced increased IL-6 and TNF-α concentrations in the supernatant of primary cell cultures from the anterior lobe of the pituitary. Additional treatment with different antibodies (IL-6-, IL-10- and TNF-α-antibody) altered the concentrations of these cytokines. Using this experimental design, interactions of different cytokines in the LPS-induced cytokines milieu of the anterior lobe of the pituitary were investigated in detail. These cytokines play (in association with NF-IL6) an important role in the adequate response of the pituitary gland to infection or stress stimuli. It was shown that NF-IL6 might play an important role in the LPS-induced synthesis of TNF-α by folliculostellate cells, which subsequently also synthesize IL-6. LPS-induced NF-IL6-immunoreactivity colocalized with induced TNF-α-immunoreactivity and elevated TNF-α levels in cell culture supernatants. Furthermore, it was found evidence that IL-6 might be involved in a NF-IL6-mediated increased expression of the POMC gene in corticotropic cells and, thus, NF-IL6 might participate in the increased ACTH-synthesis after LPS stimulation. The LPS-induced ACTH-immunoreactivity of corticotropic cells was inhibited by an IL-6-antibody and enhanced by an IL-10-antibody. IL-10 is an anti-inflammatory cytokine, which probably caused an inhibition of the synthesis of various cytokines (IL-6) and the LPS-induced ACTH-production in the pituitary by a so-called "negative feedback" mechanism. In addition, application of the JAK-STAT inhibitor AG490 moderately inhibited LPS-induced NF-IL6-expression and led to a significant reduction of TNF-α-synthesis that was accompanied by a decrease in the number of ACTH-positive cells. Thus the JAK-STAT signaling pathway seems to be involved in the process of ACTH- and TNF-α-synthesis.NF-IL-6 knock-out miceApart from the primary scope of the present study an exaggerated immune response of NF-IL6-knockout mice to foreign bodies and some alterations in the cornea of their eyes were observed. After the injection of a low dose of LPS (50 µg/kg) NF-IL6 deficient animals showed a similar fever to wild-type mice. However, towards the end of the study period (24 h) a second significant increase in the febrile response was observed only in the genetically modified animals. This is indicative for a potential role of NF-IL6 in the termination of the febrile response. Moreover, NF-IL6-knock-out mice only developed a brief but significant rise in temperature between 23-24 hours after the injection of a high dose of LPS (2.5 mg/kg). LPS-stimulated (high dose) wild-type animals showed significantly increased or altered core body temperature throughout the entire 24-hour period beside a complete loss of their circadian rhythm. In addition, both LPS doses induced anorexia and adipsia in these mice, while NF-IL6-deficient animals only showed these symptoms after the high dose of LPS. These results demonstrate that the importance of NF-IL6 for the generation of fever and other symptoms of "sickness behavior" (anorexia, adipsia) depends on the dose of the inflammatory stimulus LPS. Importantly, it was observed for the first time that NF-IL6-knock-out mice show a significantly reduced motor activity compared to wild-type animals, both after LPS injection and after an open field stress, which possibly may be linked to changes in the expression of IL-10 and dopamine in the brain.ConclusionsOn the one hand, the present study shows the multiple functional facets of the transcription factor NF-IL6 and, on the other hand, the complexity of the communication between the immune system, the central nervous system and endocrine system initiated by peripheral immune stimuli (LPS) or by stress (open field stress). The potential role of NF-IL6 in the activation of the HPA axis and in the generation of fever and brain controlled sickness symptoms point to the fact that this transcription factor will be an important target in further investigations about long-term and especially anti-inflammatory effects. Thus, NF-IL6 will be an important research object for (psycho-) neuroimmunology research. Since imbalances between the endocrine, hormonal and immunological communication exhibit significant impact on an adequate immune response during infection and inflammation, the delicate interplay of NF-IL6 and inflammatory mediators remains an important field for further studies. Overall future studies on NF-IL6-related questions will have great potential to develop new therapeutic approaches for diseases that are of growing importance including depression, rheumatism and cancer.