Untersuchungen zur Rolle des Transkriptionsfaktors NF-IL6 in der Hypothalamus-Hypophysen-Achse bei Ratten und Mäusen nach psychologischem und inflammatorischem Stress
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Zusammenfassung
Hintergrund und Zielsetzung der ArbeitMit der systemischen Injektion von Lipopolysaccharid [LPS, Zellwandbestandteil gram-negativer Bakterien und Mitglied der sog. PAMPS (Pathogen-assoziierte Molekülstrukturen)] kann bei Versuchstieren eine Entzündung nachgeahmt werden, die zentralnervös kontrollierte Krankheitssymptome wie Fieber und andere zum Komplex des sog. sickness behavior gehörende Erscheinungen (Anorexie, Adipsie und Lethargie) zur Folge hat. Der gesamte Organismus reagiert mit der sog. Akute-Phase-Reaktion (APR), um pathogene Fremdmoleküle zu bekämpfen und die ursprüngliche Homöostase wiederherzustellen. Dabei agiert das Immunsystem nicht alleine, sondern als ein Bestandteil einer Gesamtheit, die das Überleben des Organismus gewährleistet. Das Immunsystem, das zentrale Nervensystem (ZNS) und das endokrine System ermöglichen über spezielle Botenstoffe die notwendige Kommunikation zwischen Peripherie und ZNS. Anhand der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren [z. B. NFκB ( nuclear factor kappaB ), STAT3 ( signal transducer and activator of transcription 3 ), NF-IL6 ( nuclear factor for IL-6 )] lässt sich die genomische Aktivierung von Zellen innerhalb des ZNS nachweisen. Dies kann als eine Art Endpunkt der Signalübermittlung von peripheren Immunsignalen an entsprechende regulatorische Zentren des ZNS angesehen werden. Im Zuge der APR kommt es auch zur Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA-Achse), die sich aus dem hypothalamischen CRH (Corticotropin-Releasing Hormon), dem hypophysären ACTH (Adrenocorticotropes Hormon) und dem Corticosteron bzw. Cortisol aus der Nebennierenrinde zusammensetzt und einer überschießenden proinflammatorischen Antwort des Immunsystems entgegenwirken soll. Der Transkriptionsfaktor NF-IL6, welcher zur Familie der CCAAT/Enhancer-bindenden Proteine gehört, ist im Gehirn in zahlreichen Zelltypen ein Aktivitätsmarker für längerfristige Entzündungsreaktionen und seine de novo-Synthese sowie Aktivierung wird unter anderem durch IL-6 (Interleukin-6), aber auch TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) und womöglich IL-10 (Interleukin-10) initiiert. Dadurch erfolgt eine gesteigerte Expression seiner Zielgene, zu denen COX-2 (Cyclooxygenase-2), mPGES (mikrosomale Prostaglandin-E-Synthase), TNF-α und IL-10, aber auch CRH und POMC (Proopiomelanocortin) gezählt werden.In der vorliegenden Arbeit wurde die potenzielle Rolle von NF-IL6 sowohl in der LPS-induzierten als auch in der stressinduzierten HPA-Achse im Zusammenhang mit der Entstehung von Fieber und dem sog. sickness behavior analysiert. Um einen weiteren Beitrag zur Bedeutung und Funktion von NF-IL6 als späten Zellaktivierungsmarker bei systemischen Entzündungen leisten zu können, erfolgte zusätzlich eine Untersuchung von mehreren physiologischen Parametern (Körperkerntemperatur, lokomotorische Aktivität, Futter- und Trinkwasseraufnahme, Entwicklung des Körpergewichts) bei NF-IL6-defizienten Mäusen.MethodikDie Gehirne der mit verschiedenen LPS-Dosen injizierten oder durch ein Open Field Stress Versuch stimulierten Ratten bzw. NF-IL6-Knock-out-Mäuse wurden vorwiegend für immunhistochemische, aber auch zum Teil für molekularbiologische Untersuchungen verwendet. Des Weiteren wurden bei den Ratten im Open Field Stress Versuch und bei den NF-IL6-defizienten Mäusen sowohl nach Open Field Stress Versuch als auch nach LPS-Injektion die physiologischen Parameter (Körperkerntemperatur, lokomotorische Aktivität, Futter- und Trinkwasseraufnahme) telemetrisch erfasst und ausgewertet. Plasmazytokine (TNF-α und IL-6) der Versuchstiere wurden mittels Bioassay analysiert. Darüber hinaus erfolgte die Untersuchung von NF-IL6 im LPS-induzierten Zytokinmilieu einer primären Zellkultur des Hypophysenvorderlappens (HVL) von Ratten mittels verschiedener Zytokinantikörper und dem JAK-STAT-Inhibitor AG490.KernbefundeDie Rolle von NF-IL6 in der humoralen Signalweiterleitung an das ZNSZum ersten Mal konnte eine NF-IL6-Aktivierung 8 h nach einer LPS-Injektion (100 µg/kg KGW) im Bereich der Circumventrikulären Organe [OVLT (Organum vasculosum laminae terminalis), SFO (Organum subfornicale), ME (Eminentia mediana)], in Zellen des SON (Nucleus supraopticus), in Gehirnendothelzellen und im Plexus choroideus der Maus beobachtet werden. NF-IL6 scheint demzufolge speziesübergreifend (zusätzlich zur Ratte auch in der Maus) an der LPS-induzierten humoralen Signalweiterleitung beteiligt zu sein. NF-IL6 in der LPS-induzierten Hypothalamus-Hypophysen-AchseBei Ratten konnten NF-IL6-Signale in der LPS-induzierten (100 µg/kg KGW) Hypothalamus-Hypophysen-Achse sowohl auf der Ebene des Hypothalamus (PVN) als auch auf der Ebene der Hypophyse detektiert werden. Der zeitliche Höhepunkt der Immunreaktivität von NF-IL6 lag bei 8 h post injectionem (p.i.). Im Rahmen dieser Arbeit konnten in der Hypophyse corticotrope Zellen, Endothelzellen, perivaskuläre Makrophagen, Pituizyten und Neuronenausläufer aus dem PVN als NF-IL6-positiv detektiert werden. Darüber hinaus waren zum Zeitpunkt 8 h p.i. im HVL die Transkriptionsfaktoren NF-IL6, NFκB sowie STAT3 zum einen als singuläres Signal und zum anderen in Colokalisation (NF-IL6-NFκB und NF-IL6-STAT3) anzutreffen. Entsprechend der vorliegenden Daten scheint NF-IL6 sowohl an der LPS-induzierten Weiterleitung peripherer Immunstimuli als auch an der LPS-induzierten Aktivierung der HPA-Achse und möglicherweise an der Synthese von ACTH beteiligt zu sein. Die Colokalisation aktivierter einzelner Transkriptionsfaktoren dürfte ein synergistisches bzw. antagonistisches Zusammenspiel ( cross talk ) ermöglichen und damit die Expression bestimmter Zielgene (z. B. IL-6 oder POMC) in der Hypophyse beeinflussen. NF-IL6 in der stressinduzierten Hypothalamus-Hypophysen-AchseEin psychologischer Stressstimulus (Open Field Stress) bei Ratten führte nicht nur zu einer signifikanten Erhöhung der Körperkerntemperatur und einem signifikanten Anstieg der IL-6-Konzentrationen im Blut der Versuchstiere, sondern resultierte ähnlich dem infektiösen Stimulus (LPS-Injektion) in einer NF-IL6-Aktivierung im Hypothalamus (PVN) und in der Hypophyse mit einem zeitlichen Höhepunkt bei 90 Minuten nach Stressbeginn. Im Gegensatz zur LPS-induzierten Aktivierung zeigten jedoch die Endothelzellen des PVN keine NF-IL6-Signale. In der Hypophyse nahmen die perivaskulären Makrophagen eine Sonderstellung ein, da sie als einziger identifizierter Zellphänotyp ein positives NF-IL6-Signal zeigten. Somit scheint NF-IL6 zwar an der Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Achse, aber nicht an der durch einen Open Field Stress aktivierten Synthese von ACTH in corticotropen Zellen direkt beteiligt zu sein. In weiteren Open Field Stress Versuchen konnte außerdem gezeigt werden, dass NF-IL6-defiziente Mäuse im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren eine verringerte, stressinduzierte Erhöhung der Körperkerntemperatur aufwiesen. Dies belegt zum ersten Mal, dass NF-IL6 tatsächlich auch an psychologischen, stressinduzierten Reaktionen und damit wahrscheinlich an der Hypothalamus-Hypophysen-Achsen-Aktivierung beteiligt zu sein scheint. Eine solche, wahrscheinlich indirekte, Beteiligung von NF-IL6 wäre beispielsweise auch über PACAP ( pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide ) denkbar, bleibt aber in weiterführenden Studien noch zu untersuchen. NF-IL6 in follikulostellaten und corticotropen Zellen einer primären Zellkultur des HypophysenvorderlappensNach Stimulation der Zellen der primären Zellkultur mit LPS bzw. mit Interleukin-1β (IL-1β) konnten erhöhte Konzentration an IL-6 und TNF-α im Überstand gemessen werden, die durch die Anwendung verschiedener Antikörper (IL-6-, IL-10- und TNF-α-Antikörper) beeinflusst wurden. Dadurch konnte das Zusammenspiel der einzelnen Zytokine im Milieu des HVL und im Zusammenhang mit NF-IL6 näher untersucht werden, da Zytokine einen wesentlichen Beitrag zur adäquaten Reaktion der Hypophyse auf infektiöse oder stressinduzierte Stimuli leisten. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass NF-IL6 möglicherweise in der LPS-induzierten Synthese von TNF-α durch follikulostellate Zellen, die auch IL-6 synthetisieren, eine wichtige Rolle spielt. Die LPS-induzierte NF-IL6-Immunreaktivität colokalisierte mit induzierter TNF-α-Immunreaktivität sowie erhöhten TNF-α-Konzentrationen in den Zellkulturüberständen. Des Weiteren wurden Hinweise dafür gefunden, dass IL-6 womöglich an der NF-IL6-vermittelten und verstärkten Expression des POMC-Gens in corticotropen Zellen und somit auch NF-IL6 an der erhöhten ACTH-Synthese nach LPS-Stimulation beteiligt ist. Die LPS-induzierte Immunreaktivität von ACTH in corticotropen Zellen wurde durch IL-6-Antikörper gehemmt und durch IL-10-Antikörper gefördert. IL-10, als antiinflammatorisches Zytokin, führte demnach über einen negativen Feedbackmechanismus zu einer Inhibition sowohl der Synthese verschiedener Zytokine (IL-6) als auch der LPS-induzierten ACTH-Produktion in der Hypophyse. Die Anwendung des JAK-STAT-Inhibitors AG490 hemmte anteilig die LPS-induzierte NF-IL6-Expression und führte in diesem Zusammenhang nicht nur zu einer deutlichen Reduktion der TNF-α-Synthese, sondern auch zu einer Erniedrigung der Anzahl der ACTH-positiven Zellen im HVL. Dies deutet darauf hin, dass der JAK-STAT-Signalweg an diesen Prozessen (ACTH- und TNF-α-Synthese) beteiligt ist.NF-IL6-Knock-out-MäuseDie verwendeten NF-IL6-Knock-out-Mäuse zeigten als Nebenbefund eine übersteigerte Immunreaktion auf Fremdkörper und Veränderungen im Bereich der Kornea.Die Auswirkungen der NF-IL6-Defizienz auf die Thermoregulation äußerten sich nach der Injektion einer niedrigen LPS-Dosis (50 µg/kg KGW) in einer ähnlichen Fieberreaktion wie in Wildtyp-Tieren. Das Fieber stieg allerdings gegen Ende des Versuchszeitraumes (24 h) nur in den genetisch veränderten Tieren erneut signifikant an. Dies spricht für eine Bedeutung von NF-IL6 für die Beendigung einer Fieberreaktion. Des Weiteren entwickelte sich nach der Injektion einer hohen LPS-Dosis (2,5 mg/kg KGW) lediglich zwischen 23-24 Stunden ein kurzer signifikanter Fieberanstieg. Wildtyp-Tiere zeigten, neben einem völligen Verlust des Tag-Nacht-Rhythmus, über den gesamten Zeitraum von 24 Stunden eine signifikant erhöhte bzw. veränderte Körperkerntemperatur. Die Reaktion der Wildtyp-Mäuse war nach beiden LPS-Dosen von Anorexie und Adipsie begleitet, während NF-IL6-defiziente Tiere lediglich nach der hohen Dosis die oben genannten Symptome zeigten. Das heißt, dass die Bedeutung von NF-IL6 für die Fieberentstehung, aber auch für Symptome des sickness behaviors (Anorexie, Adipsie) abhängig von der Dosis des inflammatorischen Stimulus LPS ist. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal beobachtet werden, dass NF-IL6-Knock-out-Mäuse eine deutlich reduzierte motorische Aktivität im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren zeigten, sowohl nach LPS-Injektion als auch nach einem Open Field Stress, was womöglich mit Veränderungen in der Expression von IL-10 sowie Dopamin im Gehirn zusammenhängen könnte.SchlussfolgerungenDie vorliegende Arbeit zeigt zum einen die Vielschichtigkeit der Funktionen des Transkriptionsfaktors NF-IL6 und zum anderen die Komplexität der durch einen peripheren Immunstimulus (LPS) bzw. durch einen Stressstimulus (Open Field Stress) angestoßenen Kommunikationswege zwischen Immunsystem, zentralem Nervensystem und endokrinem System. Die potenzielle Rolle in der Aktivierung der HPA-Achse sowie bei der Entstehung von Fieber und zentralnervös kontrollierten Krankheitssymptomen, macht diesen Transkriptionsfaktor bei zukünftigen Untersuchungen langfristiger und vor allem anti-inflammatorischer Effekte zu einem wichtigen Untersuchungsgegenstand der (Psycho-) Neuroimmunologie. Da ein gestörtes Gleichgewicht zwischen der neuroendokrinen, hormonellen und immunologischen Kommunikation erhebliche Auswirkungen auf eine adäquate Reaktion des Immunsystems bei Infektionen und Entzündungen haben kann, stellt das diffizile Zusammenspiel von NF-IL6 und inflammatorischen Mediatoren einen wichtigen Anhaltspunkt für weitere Studien dar. Darüber hinaus besitzen zukünftige Untersuchungen ein großes Potenzial für die Entwicklung neuer Lösungsansätze im Hinblick auf therapeutische Möglichkeiten bei Krankheiten (z.B. Depressionen, rheumatische Erkrankungen sowie Krebs), deren wachsende Bedeutung auch in Zukunft die Bearbeitung weiterer Fragestellungen im Zusammenhang mit NF-IL6 erfordern werden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler