Akute Transplantatabstoßung : Möglichkeiten der immunmodulatorischen Therapie mit 3-Deazaadenosin (c3Ado) sowie Einsatz der ODN-Decoy-Technologie

Abstract

Für Patienten im Endstadium des Herzversagens hat sich die Transplantation als Therapie der Wahl etabliert und stellt sowohl eine Erhöhung der Lebensqualität als auch eine Verbesserung der Prognose dar. Um die akute Transplantatabstoßung, aber auch die chronische Transplantatdysfunktion zu verhindern, müssen die Organe so früh wie möglich vor der Schädigung durch das Immunsystem des Empfängers geschützt werden. Daher war das Ziel der Studie, Transplantat protektive Strategien zu evaluieren, welche die akute Abstoßung verhindern oder abschwächen sollen. Die Versuche wurden an einem vollständig allogenen heterotopen Ratten-Herztransplantationsmodell vorgenommen. In diesem Modell werden WF-Spenderherzen an die großen Bauchgefäße von LEW-Ratten anastomisiert und ohne Immunsuppression werden die Transplantate innerhalb 5,7±0,5 Tagen abgestoßen. In der Frühphase der akuten Abstoßung kommt es histologisch zur Expression von Adhäsionsmolekülen (ICAM-1 und VCAM-1) und in der Folge zur Infiltration der Transplantate mit immunkompetenten Zellen, wie T-Zellen und Monozyten/Makro-phagen. Diese Abstoßungskaskade wird amplifiziert durch die Expression von Mediatoren wie IL-2 und MCP-1 auf mRNA- und Protein-Ebene. In den beiden Therapiearten der Untersuchung wurden unbehandelte Tieren den behandelten gegenüber gestellt und die Transplantate wurden an den Tagen 1,3 und 6 post Transplantationem für die weiteren histologischen, immunhistochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen entnommen (n=4, bzw. n=5/Tag/Gruppe).In dem ersten Teil der Untersuchungen wurden die Tiere mit der immun-modulatorischen Substanz c3Ado behandelt (2xtäglich 2,5 mg/kg KGW s.c.). Hier zeigte sich, dass durch c3Ado die Expression der beiden Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 an den Tagen 1 und 3 hoch signifikant reduziert werden konnte. Durch diese Reduktion konnte auch die Infiltration mit mononukleären Zellen (MHC II positiv) und ganz spezifisch auch die Zahl an Monozyten/Makrophagen (ED-1 positiv) und T-Zellen (R73 positiv), die in das Organ einwandern, vermindert werden. Auch die Anzahl der Zellen, die iNOS positiv waren und die damit eine erhöhte Produktion von NO vermitteln, konnte durch die c3Ado-Gabe an den Tagen 1,3 und 6 reduziert werden. Auf molekularer Ebene zeigte sich, dass die mRNA-Konzentration der Adhäsions-moleküle nicht durch c3Ado beeinflusst wird. Daraus resultiert, dass c3Ado vermutlich posttranskriptionell die Expression der Adhäsionsmoleküle reguliert. Danach konnte demonstriert werden, dass trotz der Reduktion der Infiltration zwei zentrale Botenstoffe der akuten Abstoßung, nämlich IL-2 und MCP-1, auf mRNA-Ebene durch c3Ado nicht moduliert wird. Trotz der Verminderung der Infiltration durch immunkompetente Zellen konnte keine Verlängerung des Transplantatüberlebens erzielt werden. Dies könnte darin begründet sein, dass ein spezifischer Mechanismus des Zelluntergangs, die Apoptose durch c3Ado nicht unterdrückt werden konnte. Im Gegensatz zu einem immunmodulatorischem Ansatz, der die Immunantwort des Transplantat-Empfängers reduziert, war das Ziel der zweiten Versuchsreihe, noch früher in die Mechanismen der akuten Transplantatabstoßung einzugreifen und die Antigenität des Transplantates peri-operativ zu verringern. Durch die Inhibition zweier zentraler Transkriptionsfaktoren, AP-1 und STAT-1, sollte die intrazelluläre Signaltransduktion so moduliert werden, dass es in Folge zu einer verminderten Aktivierung der Mechanismen der akuten Transplantatabstoßung kommt. Um diese zentralen Botenstoffe, die Transkriptionsfaktoren zu inhibieren, wurde die Decoy-Technologie verwandt, indem die Transplantate in der Ischämiephase intra-operativ mit STAT-1, bzw. AP-1 Decoy-ODN-Lösung perfundierten. Diesen zwei Gruppen stellten wir wieder unbehandelte, d.h. nur mit der Perfusionslösung behandelte, akut abstoßende Tiere entgegen (n=5/Tag/Gruppe). Durch die Inhibition sowohl von AP-1 als auch STAT-1 konnte das Transplantatüberleben trotz nur einmaliger lokaler Anwendung der Decoys in der Ischämiephase des Transplantates signifikant verlängert werden. Dieser Effekt ist auf die spezifische Wirkung der beiden Decoys zurückzuführen, da es nachweislich mit mutierten ODN-Strängen zu keinerlei überlebensverlängerndem Effekt kam (n=5/Tag/Gruppe). Durch Fluoreszenzmarkierung konnten wir nachweisen, dass es zu einer Anreicherung der Decoys in den Endothelzellen der Transplantate kommt. In beiden Gruppen konnte durch den Einsatz sowohl von STAT-1 als auch AP-1-Decoys die Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 am Tag 1und am Tag 3 reduziert werden. Bei dem Adhäsionsmolekül VCAM-1 kam es am Tag 1 zu einer nahezu kompletten Inhibition der Expression. Auf mRNA-Ebene zeigte sich, dass auch in dieser Studie die verminderte Expression der Adhäsionsmoleküle nicht mit einer reduzierten mRNA-Konzentration im Gesamtlysat einhergeht. Durch die Inhibition von AP-1 als auch STAT-1 konnte zusätzlich die Anzahl der das Transplantat infiltrierenden, immunkompetenten Zellen am Tag 3 vermindert werden. Ganz spezifisch reduzierte sich die Infiltration mit Monozyten und T-Zellen signifikant am Tag 3 post Transplantationem. Obwohl die Decoys nur einmalig perioperativ eingesetzt wurden, konnte die Infiltration mit T-Zellen bis zum 6. Tag post Trans-plantationem signifikant reduziert werden. In beiden Versuchsreihen zeigte sich, dass durch die unterschiedlichen Strategien zentrale histologische Zeichen der akuten Transplantatabstoßung wie die Expression von Adhäsionsmolekülen und die folgende zelluläre Infiltration deutlich vermindert werden konnte. Diese Modulation der Mechanismen der Transplantatabstoßung in der Frühphase wurde in der zweiten Versuchsreihe durch einer Verlängerung des Transplantatüberlebens dokumentiert. Daher könnten beide Ansätze dazu dienen, neue therapeutische Ansätze zu liefern, um die kritische Zeit nach der Transplantation bis zum vollständigen Greifen der Immunsuppression zu überbrücken. Solid organ transplantation has become the treatment of choice for many patients with end stage organ failure. Despite improvements in immunosuppressive therapy, acute rejection episodes occur within the first days or weeks after engraftment with a frequency of approximately 1.3 episodes per patient during the first year after transplantation and remain an important cause of post-transplant morbidity, mortality, and graft loss. Therefore the aim of the study was to investigate two different strategies to modify the pathophysiological mechanism of acute cardiac allograft rejection. Using the WF to LEW rat cardiac allograft model, untreated grafts were rejected within 5.7±0.5 days. This is a fully allogenic heterotopic heart transplantation model. In the first days after transplantation immunhistological the expression of adhesion molecules like ICAM-1 and VCAM-1 can be detected. Furthermore during the timecourse of acute allograft rejection the grafts were infiltrated with immune competent cells like for example T-cells and Macrophages. First we investigate an immunosuppressive strategy leading to modification of the immune response of the recipient. The experimental animals therefore received 2x5mg c3Ado s.c./day (n=4, per group and time point). The aim of the second part of the study was to reduce the allogenity of the graft through the inhibition of the intracellular pathway of two transcription factors. Therefore the grafts were perfused during the transplant procedure with ODN Decoy solution (STAT-1 or AP-1 dODN solution (10 mM)) targeting the transcription factors STAT-1 and AP-1. Buffer solution or mutated control STAT-1 and AP-1 dODN (10 mM) received as adequate controls. Grafts were harvested on day 1, 3 and 6 after transplantation for further mechanistical examination (n=5, per group and time point). In c3Ado treated allografts adhesion molecule (ICAM-1,VCAM-1) expression on day 1 and 3 after transplantation was almost completely abolished compared with unmodified grafts. In later time points immunohistochemical examination of c3Ado treated grafts revealed a significant reduction in infiltrating MHC II positive cells, T-cell receptor positive cells (R73) as well as ED1 positive monocytes and macrophages at day 3 and 6 after transplantation. In contrast, c3Ado treatment was neither able to prevent apoptotic cell death (TUNEL assay and DNA laddering) in the transplanted graft at day 6 after engraftment nor to prolong allograft survival. In the second part of the study the grafts were perfused perioperativ with STAT-1 or AP-1 ODN Decoys targeting the inhibition of the intracellular pathway of these two transcription factors. As demonstrated by fluorescence dye-labelled dODNs, exposure of the grafts to the dODN solution during 45 min of warm ischemia resulted in a dominant uptake of the dODNs by graft endothelium. AP-1 and STAT-1 dODN treatment prolonged cardiac allograft survival approximately 40% from 5.6±0.5 days to 7.8±1.3 days and 7.4±0.5 days, respectively (Mean±SD, p<0.01, n=5 in each group). In contrast, treatment with vehicle or the control dODNs did not prolong cardiac allograft survival. Immunohistochemical examination on day 1, 3 and 6 revealed a marked reduction of infiltrating leukoctes, namely T-cells and macrophages, in the dODN-perfused grafts at day 3 post transplantation. In addition adhesion molecule expression (ICAM-1, VCAM-1) on vascular endothehial cells was markedly reduced. Summariesing these results the immunosuppressive strategy applying c3Ado systemically to the transplant recipient diminished the histological features of acute cardiac allograft rejection without preventing the reduction of apoptotic cell death nor to prolong cardiac allograft survival. In contrast, the treatment of the graft alone with dODNs targeting the activation of the transcription factors STAT-1 and AP-1 prevented the expression of adhesion molecule expression, reduced the infiltration of the allografts and prolonged cardiac allograft survival without any immunosuppressive therapy of the recipient. The utilization of such dODNs in a cardioplegic solution might be a novel strategy to protect transplanted organs from early damage during transplantation, to preserve organ function and bridge the critical phase after transplantation when standard immuno-suppression is not yet completely effective.