Caspase-1 abhängige-/unabhängige Freisetzung von Interleukin-1beta (IL-1beta) durch Einsatz der experimentellen Photopherese

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es die zellulären Wirkmechanismen der extrakorporalen Photopherese aufzuklären. Primär ging es darum, die zellulären Aktivierungswege aufzuklären, welche durch Einsatz der experimentellen Photopherese, zu einer Zytokinfreisetzung in Leukozyten führten. Dafür erfolgten in-vitro Versuche mit humanen- als auch murinen-Zelltypen, sowie klinischen Proben. Im Verlauf der Versuche stellte sich heraus, dass durch Einsatz der experimentellen Photopherese die eingesetzten Zellen soweit moduliert werden konnten, dass sie Interleukin-1ß freisetzen konnten. Es erfolgten Versuchsreihen in An- bzw. Abwesenheit der Priming-Substanz LPS. Dabei konnte beobachtet werden, dass der Einsatz der experimentellen Photopherese in beiden Versuchsanordnungen in der Lage war eine IL-1ß Freisetzung zu verstärken. Die Freisetzungsrate war in Anwesenheit von LPS höher als in Abwesenheit. Jedoch konnte durch Versuche ohne LPS gezeigt werden, dass die experimentelle Photopherese die Freisetzung von IL-1ß verstärken kann, und somit als eine weitere Substanz identifiziert wurde die neben den aus der Literatur bekannten Substanzen auch in der Lage ist eine Entzündung hervorzurufen. Um bestimmen zu können, über welche zellulären Mechanismen bzw. über welchen Signalweg die Freisetzung erfolgte, wurden ausgewählte Knockout-Mäuse eingesetzt. Es stellte sich heraus, dass der Einsatz der experimentellen Photopherese die zur Prozessierung der pro-IL-1ß Form nötige Caspase-1 aktivieren kann, über die anschließend die Prozessierung anhand durchgeführter Western-Blots auch gezeigt werden konnte. Damit stellte sich die Frage, ob es sich bei diesem Prozess um eine Inflammasom-abhängige Freisetzung von IL-1ß handelt. Um die Frage beantworten zu können, wurden ASC- sowie AIM2-KO Mäuse in Anwesenheit von LPS mit experimenteller Photopherese behandelt. So konnte anhand von Western-Blot Analysen sowohl eine Caspase-1-Aktivierung als auch eine pro-IL-1ß-Prozessierung aufgezeigt werden. Die in Western-Blot erzielten Daten deckten sich somit mit aus dem Überstand mittels ELISA erzielten Zytokinmessungen, bei denen in allen eingesetzten Knockout-Mäusen eine IL-1ß Freisetzung nachweisbar war. Da eine Freisetzung maturen-IL-1ß auch in der Caspase-1-KO Maus nachgewiesen werden konnte, kann spekuliert werden, dass es sich bei der Prozessierung nicht nur um eine Caspase-1-abhängige, sondern auch um eine Caspase-1-unabhängige Prozessierung handeln könnte. Die Ergebnisse belegen, dass die experimentelle Photopherese, sowohl über Caspase-1-abhängige als auch Caspase-1-unabhängige Signalwege die IL-1ß Freisetzung verstärkt.Die Wirkung der experimentellen Photopherese auf die IL-1ß Freisetzung konnte auch anhand klinischer Proben bestätigt werden. So war es möglich im Vergleich zu unbehandelten Proben, eine erhöhte IL-1ß Freisetzung in ECP-behandelten Leukapheresat- und Vollblut-Proben von Patienten nachzuweisen.

The aim of the present work was to clarify the cellular mechanisms of action of the extracorporeal photopheresis, to try to explain the cellular activation pathways which, through the use of the experimental photopheresis, lead to cytokine release in leukocytes. In-vitro experiments were made with human and murine-cell types as well as with clinical samples. They revealed that the use of the experimental photopheresis modulates the cells to release interleukin-1ß. Experiments were made with and without the priming substance LPS. Both experimental setups showed that the application of the experimental photopheresis was able to promote IL-1ß release. The release rate was higher in the presence of LPS than in its absence. It was demonstrated however, that without LPS the experimental photopheresis can promote the release of IL-1ß and therefore, besides the substances known from the literature, reveal another substance that is also able to cause inflammation. Knockout mice were selected In order to be able to determine which cellular mechanisms or which signal pathway triggered the release. It turned out that the experimental photopheresis activates the caspase-1 which is necessary for the processing of the pro-IL-1ß form. This processing could be confirmed through western-blots. The question was raised then, whether this process was an inflammasome-dependent release of IL-1ß. To answer this question, ASC- and AIM2-KO mice were tested with experimental photopheresis in presence of LPS. Western-blot analyses revealed both a caspase-1 activation and a pro-IL-1ß-processing. These results were confirmed through ELISA cytokine measurements where a release of IL-1ß was detected in all the tested knockout mice. Since the release of mature-IL-1ß was also demonstrated in the caspase-1-KO mice, one may speculate that the processing may not be exclusively caspase-1-dependent but also caspase-1-independent. It indicates that experimental photopheresis increases the IL-1ß release both through caspase-1-dependent and caspase-1-independent pathways. We could confirm the effect of the experimental photopheresis on IL-1ß release also with the help of clinical samples. Thus it was possible to demonstrate that samples showed a raised IL-1ß release in ECP treated blood-leukapheresis and full blood-tests of patients after LPS priming when compared to controls.